[發明專利]絨山羊VEGF164基因cDNA核苷酸序列及其毛囊特異性表達載體

無效

• 申請號: 201010556622.4
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN101988066A
• 公開（公告）日: 2011-03-23
• 發明（設計）人: 王志鋼;侯鑫;劉俊娥;郭旭東;鮑文蕾;李彬;劉東軍
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/85;C07K14/475
• 代理公司: 北京中知法苑知識產權代理事務所 11226
• 代理人: 常玉明;張蘭海

技術領域

本發明涉及從體外培養的絨山羊胎兒成纖維細胞分離的編碼VEGF164蛋白的cDNA及其毛囊特異性表達載體，更具體地說涉及編碼VEGF164蛋白質的cDNA的573bp的核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列及將克隆到的VEGF164基因與毛囊特異性的KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接構成VEGF164毛囊特異性表達載體pCDsRed-KV。

背景技術

內蒙古白絨山羊是經過長期自然選育形成的優良地方性絨肉兼用型品種，所產羊絨具有徑細絨長、綜合品質優良的特點，但由于近年來草場退化，種群數量增加，舍飼比例加大，導致產絨量降低。通過轉基因技術導入促進毛囊發育和絨毛生長的功能基因，培育高產絨量新品系是解決這一問題的有效手段。血管內皮生長因子是一種二聚體糖蛋白，具有促進毛囊發育和毛發生長的功能。克隆內蒙古白絨山羊血管內皮生長因子(VEGF164)基因并構建毛囊特異性表達載體，穩定轉染胎兒成纖維細胞，篩選得到轉基因細胞克隆，將為通過核移植方法獲得高產絨量轉基因絨山羊新品種提供條件。

血管內皮生長因子是1979年Dvorak等首先在無血清的腫瘤細胞培養液及動物癌性腹水中發現，Senger等(1983)分析后確定是一種以二硫鍵結合的二聚體肝素親合性糖蛋白并命名為血管滲透因子(vascular?permeability?factor，VPF)。Gospodarowicz和Ferrara等(1989)從牛的垂體濾泡細胞中分離得到類似物，命名為血管內皮生長因子(vascular?endothelial?cell?growth?factor，VEGF)，后經分析發現二者是同一種細胞因子，具有特異作用于血管內皮細胞的特異性，在體外可誘導血管發生，并可增加血管壁的通透性，促進血管內皮細胞的增殖和遷移，促進傷口愈合及在惡性腫瘤中過表達等。近年的研究發現VEGF可明顯促進毛乳頭細胞的增殖和遷移，轉VEGF基因小鼠可以促進毛發生長。進一步的研究表明(Man等，2009)VEGF是毛乳頭細胞的一種自分泌生長因子，在人初級毛囊中有表達，在外分泌汗腺的囊泡基底膜中的表達量也非常豐富。VEGF與動物毛囊發育和毛發生長密切相關。

迄今，關于VEGF在大鼠和小鼠中已被證實可以促進毛發的生長，但與絨山羊相關的研究還未見報道。也未見有絨山羊VEGF基因的cDNA核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。

在各種情況下，有重要的原因研究和開發與絨山羊VEGF蛋白相關的基因克隆及其重組表達，因為研究清楚絨山羊的VEGF基因和蛋白的功能，可以用在通過轉基因克隆技術培育高產絨量絨山羊，提高絨毛產量等方面，得到的絨山羊VEGF164基因的核苷酸序列可以用于通過RT-PCR方法或雜交的方法檢測VEGF164基因在絨山羊不同組織和不同發育階段的表達特性。

發明內容

本發明的目的是通過已知的不同物種的VEGF基因的核苷酸序列設計引物，然后通過RT-PCR方法克隆絨山羊VEGF164基因的cDNA片段。對該片段測序后提供編碼絨山羊VEGF164蛋白的基因cDNA的573bp的核苷酸序列和由此序列推斷的氨基酸序列；將克隆到的VEGF164基因與毛囊特異性的KAP6-1基因啟動子片段以及紅色熒光蛋白表達元件連接構成VEGF164毛囊特異性表達載體pCDsRed-KV，穩定轉染絨山羊胎兒成纖維細胞后獲得了具有紅色熒光蛋白和新霉素抗性雙選擇標記的轉基因細胞克隆，可以作為轉基因體細胞核供體用于細胞核移植，為利用克隆技術培育高產絨量絨山羊新品系提供了條件。

本發明的基因產品采用以下方式表述：

1、絨山羊VEGF164基因cDNA片段，它的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所述。

2、由權利要求1中cDNA的核苷酸序列推斷出的絨山羊VEGF164蛋白質的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所述。

3、構建的絨山羊VEGF164基因毛囊特異性表達載體pCDsRed-KV如圖9所示。

本發明的基因產品的制備方法概述為：