[發(fā)明專利]具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010553433.1
• 申請日: 2010-11-22
• 公開（公告）號: CN102477083A
• 公開（公告）日: 2012-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜沖
• 申請（專利權(quán)）人: 大連創(chuàng)達(dá)技術(shù)交易市場有限公司
• 主分類號: C07K7/64
• 分類號: C07K7/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的是涉及一種具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽。

背景技術(shù)

本發(fā)明公開了兩種與癌胚抗原特異性結(jié)合的環(huán)七肽，及其與腫瘤壞死因子的融合蛋白，更具體地說，包括兩條結(jié)合肽的氨基酸序列、核昔酸序列和融合蛋白的氨基酸序列、核普酸序列以及構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)載體。

癌胚抗原（carcinoembryonic?antign?,?CEA）是一種腫瘤標(biāo)志物和腫瘤相關(guān)性抗原，高表達(dá)于上皮源性的腫瘤組織，尤其是消化道腫瘤如結(jié)腸癌、直腸癌中。針對?CEA?的導(dǎo)向治療主要集中于特異性結(jié)合?CEA?的抗體或單鏈抗體的研究，將單抗或單鏈抗體與細(xì)胞毒素如阿霉素、氨甲喋呤、腫瘤壞死因子等偶聯(lián)，通過單抗的特異性結(jié)合作用使毒素能富集于腫瘤部位，提高靶部位的藥濃度，從而達(dá)到導(dǎo)向治療、降低毒副作用的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述抗癌藥物研發(fā)現(xiàn)狀，提供一種具有導(dǎo)向治療低毒副作用的癌胚抗原特異性結(jié)合肽，從而克服單抗和單鏈抗體分子量大，穿透力弱，難以到達(dá)靶部位尤其是實(shí)體瘤組織的缺點(diǎn)。并且鼠源性的單抗應(yīng)用于人體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體，而小肽則具有免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)途徑是從噬菌體展示肽庫中篩選出?CEA?的特異性結(jié)合肚，將此結(jié)合肽與腫瘤壞死因子（TNF-α）融合表達(dá)，形成融合蛋白，以使結(jié)合肽的?CEA?結(jié)合活性與TNF-α的細(xì)胞毒活性偶聯(lián)，該融合蛋白為、能導(dǎo)向殺傷?CEA?陽性腫瘤。其特征為：l）從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫中篩選出與?CEA?特異結(jié)合的環(huán)七肽。?2?)?CEA?結(jié)合肽的氨基酸序列為：?CPAPWGRLC?。?3?）構(gòu)建序列為?CPAPWGRLC?的結(jié)合肽?CSP-1與TNF-α的融合蛋白?CSP-1-TNF?的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。?4?）構(gòu)建序列為?CLRGWPAPC?的結(jié)合肽?CSP-2?與TNF-α的融合蛋白?CSP-2-TNF?的表達(dá)載體，二者之間加入兩個(gè)甘氨酸作為柔性接頭。?5?）表達(dá)并純化?CSP-1-TNF?、?CSP-2-TNF?，檢測表明上述二者均能與?CEA?特異性結(jié)合，并且能夠競爭抑制篩選出的與?CEA?結(jié)合的單克隆噬菌體與?CEA?的結(jié)合。?6?)?CSP-1-TNF?、?CSP-2-TNF均有殺傷?L929?細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，?CSP-1-TNF?具有對?LoVo細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

附圖說明

圖?1?CAE?結(jié)合肽的氨基酸序列?330-339?為小肽的編號，氨基酸序列從左到右為?N?端到?C?端；

圖?2?噬菌體單克隆與?CEA?親和力比較；

圖?3?噬菌體單克隆特異性的比較；

圖?4?CSP-1-TNF?表達(dá)載體?pBV220-CSP-l-TNF?的構(gòu)建圖；

圖?5?CSP-2-TNF?表達(dá)載體?pBV220-CSP-2-TNF?的構(gòu)建圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：?CEA?結(jié)合肽的篩選以?CEA?為靶蛋白從噬菌體隨機(jī)展示環(huán)七肽庫中篩選與?CEA?特異結(jié)合的結(jié)合肽，經(jīng)過四輪的篩選，得到了一系列與?CEA?特異結(jié)合的噬菌體單克隆，從中隨機(jī)挑取?10?個(gè)單克隆測序，其外源展示肽序列見圖?1?。

用?ELISA?的方法檢測各個(gè)單克隆噬菌體的?CEA?結(jié)合力的大小及特異性（圖?2?、圖?3?)?，確定結(jié)合力和特異性最好的的單克隆的外源展示肽的序列為?PAPWGRL?，因?yàn)槭黔h(huán)肽庫，所以結(jié)合肽應(yīng)在兩側(cè)加上半肽氨酸，即：?CPAPWGRLC?。

實(shí)施例二：?CSP-1-TNF?表達(dá)載體的構(gòu)建（圖?4?)?

1?．合成?CSP-1?的基因

合成?CSP-1?基因的兩互補(bǔ)片段，并在其基因的?5?’端加上兩個(gè)甘氨酸的基因密碼子，基因兩側(cè)分別加上?EcoR?工的酶切位點(diǎn)。

片段?1?:

5?'?AATTCACCACCGCACAGACGACCCCACGGAGCCGGGCACATG?3?'?

片段?2?:?

5?'?AATTCATGTGCCCGGCTCCGTGGGGTCGTCTGTGCGGTGGTG?3?'?

將片段?1?和?2?等比例混勻，?94?℃?水浴變性?3min?，待其慢慢冷卻至室溫，使兩互補(bǔ)片段退火。

酶切并連接?