[發(fā)明專利]用于檢測(cè)牛CD18基因D128G突變的引物和探針

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010547546.0
• 申請(qǐng)日: 2010-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102002527A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張沅;范學(xué)華;張毅;孫東曉;王雅春;俞英;張勝利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及用于檢測(cè)牛CD18基因D128G突變的引物和特異性的TaqMan?MGB探針。

背景技術(shù)

牛白細(xì)胞粘附缺陷病(Bovine?Leukocyte?Adhesion?Deficiency，BLAD)是一種先天性免疫缺陷病，呈常染色體隱性遺傳。致病的分子遺傳機(jī)制是牛1號(hào)染色體(BTA1)上的CD18基因編碼區(qū)第383位的堿基發(fā)生A→G突變，導(dǎo)致位于該基因高度保守區(qū)的第128位氨基酸由天門冬氨酸變?yōu)楦拾彼?D128G)，致使白細(xì)胞表面的B2整合素表達(dá)明顯減少，進(jìn)而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞不能黏附到血管壁而到達(dá)炎癥部位發(fā)揮清除病原作用，使機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的重復(fù)感染。

BLAD患病牛以重復(fù)性感染和噬中性粒細(xì)胞增多為典型臨床癥狀。BLAD犢牛易受一系列細(xì)菌和真菌感染，多種組織器官的損傷均可能會(huì)發(fā)生，如口腔大面積潰瘍、壞死性口腔炎和牙周炎、牙齒脫落、牙槽骨膜炎、大面積腳癬等，此外還發(fā)現(xiàn)有多病灶的慢性潰瘍壞死性腸炎、鼻炎、化膿性支氣管炎。患牛出生后，生長(zhǎng)發(fā)育極差，其中絕大多數(shù)將會(huì)在2年內(nèi)死亡，且無(wú)繁殖和哺育能力。

BLAD病例早在1983年即被發(fā)現(xiàn)，1992其分子機(jī)制被揭示并建立了基于PCR-RFLP技術(shù)的分子檢測(cè)方法。在歐美奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的荷斯坦牛育種中，均嚴(yán)格監(jiān)控和篩查牛群的BLAD基因攜帶者，種牛系譜信息中需標(biāo)注BLAD的基因型，配種時(shí)避免出現(xiàn)攜帶者之間的交配，不斷淘汰BLAD攜帶者種公牛，從而逐步降低牛群中BLAD基因頻率。

近年來(lái)，我國(guó)大量地從國(guó)外進(jìn)口種牛、胚胎和冷凍精液，一方面充分利用了國(guó)際上優(yōu)秀種質(zhì)資源，有利于提高我國(guó)奶牛的遺傳改良進(jìn)展，但另一方面，也增加了遺傳缺陷在我國(guó)范圍內(nèi)快速傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要建立起重要遺傳缺陷的檢測(cè)方法，嚴(yán)格控制遺傳缺陷的發(fā)生。

最近國(guó)內(nèi)研究人員在我國(guó)荷斯坦牛中也檢測(cè)到BLAD攜帶者，警示我國(guó)奶牛育種中亟待開(kāi)展BLAD篩查，在種公牛中淘汰攜帶者，從而降低該遺傳缺陷對(duì)我國(guó)牛群的威脅。借助分子檢測(cè)方法確定公牛D128G突變的基因型，在種公牛中逐漸淘汰BLAD攜帶者，是降低BLAD遺傳缺陷基因頻率的有效措施。

由于CD18基因D128G突變位點(diǎn)可以被限制性內(nèi)切酶TaqI識(shí)別，因此檢測(cè)該位點(diǎn)通常都采用PCR-RFLP技術(shù)。該技術(shù)將PCR與RFLP相結(jié)合，是一種常用的單核苷酸突變(SNP)檢測(cè)方法。基本原理是，在SNP位點(diǎn)兩側(cè)先設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，使用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的DNA片段，再利用SNP位點(diǎn)的不同等位基因?qū)е略黾右粋€(gè)酶切位點(diǎn)或使酶切位點(diǎn)消失的特性，將擴(kuò)增產(chǎn)物用特異的限制性內(nèi)切酶消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，即可根據(jù)酶切產(chǎn)條帶判定基因型。檢測(cè)過(guò)程需要3個(gè)步驟：①利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的片段；②擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶消化；③酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。可以看出，該方法需要3個(gè)步驟才能獲得基因型，因此存在步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度低、檢測(cè)結(jié)果易受實(shí)驗(yàn)條件的影響等缺點(diǎn)。

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)，是由美國(guó)ABI公司研發(fā)的SNP等位基因分型技術(shù)，是利用DNA聚合酶的5′→3′核酸酶外切功能來(lái)水解探針，通過(guò)探針報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的基因型。等位基因分型需要兩條探針(TaqMan探針)和一對(duì)引物，一條探針對(duì)應(yīng)一個(gè)等位基因，每條探針在5′和3′各有一個(gè)含有熒光的報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，由于報(bào)告基團(tuán)距離淬滅基團(tuán)很近，報(bào)告基團(tuán)的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收。在PCR進(jìn)行過(guò)程中，正反向引物在DNA聚合酶的引導(dǎo)下合成一個(gè)特定分子DNA，探針可以和目的DNA雜交，DNA聚合酶的5′-3′核酸酶外切功能可以水解這個(gè)雜合分子，這樣探針被水解后，5′和3′的報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)被分開(kāi)，5′報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的顏色可以判定等位基因的基因型。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，儀器每個(gè)PCR循環(huán)過(guò)程中收集一次熒光信號(hào)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行熒光信號(hào)不斷累積，根據(jù)熒光信號(hào)的種類及信號(hào)強(qiáng)度，判定SNP基因型。TaqMan?MGB探針是對(duì)傳統(tǒng)TaqMan探針的改進(jìn)，其優(yōu)點(diǎn)是3′端的淬滅基團(tuán)是不發(fā)光的淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent?Quencher，NFQ)，因此當(dāng)淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾；此外，TaqMan?MGB探針還具有更強(qiáng)的序列特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確可靠等優(yōu)點(diǎn)。總之，TaqMan探針技術(shù)與傳統(tǒng)的SNP檢測(cè)技術(shù)相比，速度快，靈敏度高，自動(dòng)化程度高，而且經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)即可判型，反應(yīng)全過(guò)程在封閉的管內(nèi)進(jìn)行，減少了交叉污染。