[發明專利]一種多活性肽的串聯DNA、構建方法、表達載體

無效

• 申請號: 201010546969.0
• 申請日: 2010-11-17
• 公開（公告）號: CN102102104A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發明（設計）人: 馬海樂;李云亮;任曉鋒;黃六容;曲文娟
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/63
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及生物工程領域，更具體地說涉及構建一種多活性肽串聯DNA，利用其表達載體制備所述多活性肽的方法，和所述的多活性肽的醫學用途。

背景技術

生物活性肽是蛋白質中天然氨基酸以不同組成和排列方式構成的從二肽到復雜的線性、環形結構的不同肽類的總稱，是源于蛋白質的多功能化合物?；钚噪木哂卸喾N人體代謝和生理調節功能，易消化吸收，有促進免疫、激素調節、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性高，是當前國際食品界最熱門的研究課題和極具發展前景的功能因子。

在治療原發性高血壓藥物研究中，目前已從天然食物蛋白質中分離出了具有降血壓功能的生物活性肽，此類活性肽則是通過抑制血漿和血管內皮細胞血管緊張素酶（Angiotensin?I-Converting?Enzyme，ACE）的活性，達到降低血壓的目的。因其降血壓效果明顯、安全無毒副作用，已成為活性肽研究的熱點?，F在已陸續從多種動植物原料及下腳料中，如蝮蛇蛇毒、沙丁魚、乳酪、大豆豆粕、發酵豆奶、玉米渣膠、原蛋白（參見：黃家音.?等人，食品與發酵工業，32:?81-86（2006））等分離出了多種具有降血壓功能的活性多肽。

目前從牛乳蛋白酶解產物中發現了多種具有降血壓功能的多肽，其中研究比較多的是多肽CEI-12（Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Glu-Val-Phe-Gly-Lys）、多肽CEI-5（Phe-Phe-Val-Ala-

Pro）、多肽CEI-7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）、多肽CEI-β7（Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg）等（參見：董開發．等人，中國食品學報，4:86-90（2004））具有良好的降血壓效果。

由于牛乳蛋白酶解產物為多肽混合物，種類繁多，活性差異很大，真正具有高活性的多肽的產率并不很高，對此分離純化是活性富集的重要操作，但實踐證明要達到對高活性多肽有效的分離純化非常困難，成本大幅度增高。因此酶解產物很難成為制備高活性降血壓藥物的原料，限制了該產業的深入發展。

生物工程技術的快速發展為克服上述問題，實現活性肽的高效制備提供了可能。利用工程菌高效表達單一活性肽在抗菌肽、腫瘤抑制肽等的應用（參見：胡學軍．等人，中國生物化學與分子生物學報，18（3）:?287-292（2002）；馬洪星．等人，國際遺傳學雜志，30:?169-172（2007）。），已經取得了成功。在對乳源性降血壓肽CEI-12研究中，有研究者使用較大的融合蛋白（分子量為29?kDa左右）融合表達未串聯的12個氨基酸CEI-12序列（分子量為1.3?kDa左右），表達效率極低（參見：Lv，G.S．等人，J．Dairy?Sci．，86:1927-1931（2003）），同時因為牛乳蛋白酶解產物為多肽混合物，包含了多種高活性多肽成分，僅僅利用工程菌表達其中單一活性肽可能達不到很好的降血壓效果。因此研究構建利用較小的融合蛋白標簽融合表達兩種或兩種以上串聯降血壓肽基因，以期提高降血壓肽表達效率和降血壓活性，就顯得很有必要。目前利用工程菌表達乳源性降血壓活性肽的研究很少，利用工程菌同時表達兩種或兩種以上的降血壓肽的研究更未見報道。

發明內容

本發明以兩種乳源性降血壓肽的制備為例，說明多活性肽的交替串聯DNA的構建與表達。

本發明的第一方面提供了編碼兩種乳源性降血壓肽CEI-12和CEI-7的串聯DNA，該基因具有如SEQ?ID?NO1所示的核苷酸序列。

本發明的第二方面提供了構建上述兩種降血壓肽串聯DNA的方法，該方法將編碼降血壓肽CEI-12和CEI-7的核苷酸序列交替串聯3次，該核苷酸序列對應的氨基酸序列可在胰蛋白酶作用下重新酶解成CEI-12和CEI-7兩個多肽片段。

本發明的第三方面提供了含有上述兩種降血壓肽串聯DNA的表達載體pET30a-CEI-12,7。

本發明的優點是：利用pET-30a上較小的His標簽片斷融合表達交替串聯3次CEI-12和CEI-7多肽，增加了重組蛋白中目的多肽所占的比例，大大增加表達效率和減小了小肽的分離難度。

附圖說明

圖1顯示了大腸桿菌BL21-MF3A3菌落PCR電泳圖，說明該工程菌的質粒插入了大小為120bp左右目的基因；其中注：1、pET-30a⁺目的基因，2、pET-30a空載體，3、Marker；