[發明專利]一種同時標記腫瘤IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法

有效

• 申請號: 201010546038.0
• 申請日: 2010-11-16
• 公開（公告）號: CN102072959A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 彭春偉;李雁;龐代文;朱小波
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/533
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于組織免疫熒光技術領域，更具體涉及一種檢測腫瘤間質IV型膠原、巨噬細胞和腫瘤新生血管的量子點三色熒光標記方法，適用于人腫瘤組織微環境成分變化的準確、定量檢測。

背景技術

腫瘤的發生、發展不僅涉及腫瘤細胞本身，而且還與腫瘤細胞周圍的微環境有密切關系。惡性腫瘤（腫瘤）微環境由腫瘤細胞及其周圍纖維母細胞、上皮細胞、固有及特異性免疫細胞、腫瘤血管、間葉細胞及其表達產物、代謝產物。腫瘤微環境內成分眾多，因缺乏有效地技術，當前對腫瘤微環境的研究仍然以單一成分為主，無法同時顯示腫瘤微環境內的多種改變，如腫瘤間質的重塑、巨噬細胞浸潤和腫瘤血管發生。

腫瘤微環境成分眾多且相互作用的特性提示研究腫瘤微環境必須有良好的標記技術能同時研究多種成分。石蠟切片免疫組織化學染色在一定程度上標記特定分子，在腫瘤病理研究中有重要意義。但該方法染色背景高、特異性差，而且傳統的酶-底物顯色系統依賴于色原的沉積，在組織上非常近似，難以同時觀察一張切片同一部位兩種抗原的共表達定位。這種局限性使其無法滿足腫瘤多成分標記的需要。雖然免疫熒光標記抗原也是研究腫瘤的常用方法，且比酶-底物顯示系統更有優勢，但異硫氰酸熒光素（fluorescein?isothiocyanate，FITC）、羅丹明（rhodamine）等普通有機熒光基團敏感度低，發生光譜寬而重疊，抗光漂白能力差，且與組織的高自發熒光難以區分。此外，在傳統的免疫熒光雙標染色法中，有機染料必須在不同波長下激發，然后利用圖像處理軟件進行圖像疊加，才能獲得合成的最后的熒光雙標染色結果。因此，普通有機熒光染料也不能滿足多重染色的需要。

量子點是直徑2~10nm的近球形納米顆粒，半徑小于或接近于激子玻爾半徑的新型半導體納米晶粒，與傳統有機熒光染料、熒光蛋白和稀土元素螯合物相比，量子點有諸多優勢，激發光波譜寬、連續，紫外光可以激發任何大小的量子點，發射光波譜窄而對稱；光穩定性好。這些特性使量子點在生物成像領域具有獨特的優勢，在腫瘤研究中具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種同時標記腫瘤間質IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法，本發明中提供的量子點多重染色方法可用于腫瘤組織微環境多種成分的高效、準確、快速、同時檢測，該方法可推廣用于一種操作步驟簡單、快速、靈敏、高效、經濟實用的通用腫瘤微環境分子病理學檢測技術。

一種同時標記腫瘤間質IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法，其步驟是：

A、??????????????福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織4μm厚切片，固定于經多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。

B、?????組織切片的準備，?將組織切片放入二甲苯中脫蠟三次（不同的器皿中），每次4-6分鐘，脫蠟后將組織切片依次放入無水乙醇4-6分鐘、95%（體積比，以下相同）酒精1-3分鐘、95%酒精1-3分鐘和80%酒精1-3分鐘，流水沖洗3~5分鐘。

C、?????抗原修復，用檸檬酸三鈉29.41g，雙蒸水1000ml配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬酸10.5g，雙蒸水500?ml配制檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20.25ml、檸檬酸緩沖液4.75ml和225ml雙蒸水配制成檸檬酸抗原修復液（0.01mol，pH?6.0，250ml）。將組織切片置于加入了250ml抗原修復液的抗原修復盒中微波修復，即低火（微波功率：136W）修復4-6分鐘后轉至中火（微波功率：440W）修復9-11分鐘，然后室溫（20~25℃以下相同）放置待玻片自然冷卻至36-38℃。

D、????自來水沖洗后取出切片，洗滌切片，用三羥基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane,?Tris）6.05g和氯化鈉38.0g及雙蒸水5000ml，配制0.01M/L、pH7.2-7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（tris?buffered?saline,?TBS）作為洗滌液，洗滌3次，每次3分鐘；

E、?封閉，封閉液位含有2%wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封閉條件為：濕盒孵育，37℃,?30min；

F、加一抗，去除上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體、兔抗人IV型膠原多克隆抗體、山羊抗人CD105多克隆抗體的一抗混合物，37℃濕盒內孵育3~4h或4℃冰箱過夜（不少于12h）；所述的一抗為對應的免疫球蛋白G（Ig?G）抗原結合片段。?

G、??????????????洗滌切片，清洗液為(含0.5%/vol/vol吐溫#20的TBS（TBST），洗滌3次，每次3min；