[發(fā)明專利]氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010537600.3 | 申請日： | 2010-11-10 |
| 公開（公告）號： | CN102466704A | 公開（公告）日： | 2012-05-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王爾中 | 申請（專利權(quán)）人： | 蘇州艾杰生物科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/52 | 分類號： | G01N33/52;G01N21/31;G01N21/33;C12Q1/48;C12Q1/32 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 215006 江蘇省*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 離子 測定 方法 診斷 試劑盒 | ||
【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。?
【背景技術(shù)】
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。?
擴散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴散法更準(zhǔn)確，CV為8％～13％；離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5％～4.8％，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。?
檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。?
【發(fā)明內(nèi)容】
[要解決的技術(shù)問題]?
本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。?
本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。?
[技術(shù)方案]?
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。?
本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)的聯(lián)用技術(shù)，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。?
本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述氨激酶、丙酮酸激酶、章魚堿脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成：?
氨+腺苷三磷酸????氨激酶????腺苷二磷酸+磷酰胺?
腺苷二磷酸+烯醇式丙酮酸????丙酮酸激酶????腺苷三磷酸+丙酮酸?
丙酮酸+精氨酸+還原型輔酶????章魚堿脫氫酶
??????????????????????N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+輔酶+水?
本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia?kinase；EC?2.7.3.8)酶(偶)聯(lián)丙酮酸激酶(Pyruvate?Kinase；EC?2.7.1.40)、章魚堿脫氫酶(Octopine?dehydrogenase；EC1.5.1.11)酶促反應(yīng)比色終點法。氨激酶酶解氨反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸激酶、章魚堿脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。?
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。?
本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下：?
A、樣品準(zhǔn)備：?
A.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備?
將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；
A.2待測樣品的制備?
待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；?
A.3空白樣品?
所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；?
B、試劑溶液的制備：?
分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨激酶、丙酮酸激酶、章魚堿脫氫酶、腺苷三磷酸、烯醇式丙酮酸與精氨酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L與1-100mmol/L；?
C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45℃下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；?
D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化；?
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