[發(fā)明專利]一種稀有放線菌的分離方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010535808.1
• 申請(qǐng)日: 2010-11-09
• 公開（公告）號(hào): CN101974470A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉保平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于稀有放線菌的分離。

背景技術(shù)

放線菌是抗生素、酶和酶抑制劑的重要來源，稀有放線菌(rare?actinomycete)指用常規(guī)的分離程序和分離手段進(jìn)行樣品分離時(shí)，一些出現(xiàn)頻率要比常見的鏈霉菌低得多的類群。也有學(xué)者把所有的非鏈霉菌歸為稀有放線菌。放線菌的最主要分離源是土壤，鏈霉菌是其優(yōu)勢(shì)菌群，而非鏈霉菌的分布密度相對(duì)來說非常低。

迄今許多已知具有商業(yè)意義的代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，幾乎均是依靠新的篩選系統(tǒng)及新的微生物分離和鑒定技術(shù)的使用。然而，由于長(zhǎng)期以來在天然產(chǎn)物的篩選過程中使用傳統(tǒng)的菌種分離和鑒定技術(shù)，導(dǎo)致大量缺乏明確鑒定的菌株被重復(fù)分離和使用，因此從中發(fā)現(xiàn)新化合物的概率在逐漸降低，嚴(yán)重的影響著新的生物活性物質(zhì)的篩選效率。通過新的和稀有放線菌的分離，尋找和發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，其潛力仍然是其他生物無法比擬的。

土壤是微生物的大本營，用放線菌選擇培養(yǎng)基和常規(guī)的稀釋平板涂布法偏向于分離數(shù)目占優(yōu)且在培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)放線菌，而忽視生長(zhǎng)緩慢、數(shù)目稀少、緊密結(jié)合于土壤微小顆粒的放線菌。稀釋法只適合分離容易進(jìn)入水溶液的微生物或其繁殖體，因而特別偏向于多產(chǎn)孢子的真菌、單細(xì)胞的細(xì)菌、有鞭毛可運(yùn)動(dòng)的、在土壤中數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的菌群，而有些放線菌產(chǎn)生的假根容易長(zhǎng)入營養(yǎng)基質(zhì)，不容易與土壤顆粒分離，還不易產(chǎn)生無性孢子，因而不容易進(jìn)入溶液，使用稀釋法難以分離這類放線菌。如果不經(jīng)過無菌水淘洗以土壤樣品直接接種于放線菌選擇培養(yǎng)基，則容易受到其他優(yōu)勢(shì)放線菌、甚至細(xì)菌和真菌的干擾而難以分離。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是減少土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的干擾，提高分離稀有放線菌的成功率。

本發(fā)明的目的是通過以下關(guān)鍵技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種稀有放線菌的分離方法，包括無菌水淘洗法和沉淀泥接種法這兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。

無菌水淘洗法是用無菌水對(duì)土壤樣品進(jìn)行多次淘洗以減少優(yōu)勢(shì)菌的干擾。

沉淀泥接種法是將經(jīng)過無菌水多次淘洗的土壤樣品沉淀泥接種于放線菌選擇培養(yǎng)基上以提高分離稀有放線菌的成功率。

本發(fā)明的有益效果是：可以極大減少能進(jìn)入水溶液的微生物的干擾，而直接分離依附于土壤顆粒上的放線菌，提高分離稀有放線菌的成功率。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例包括三個(gè)步驟：1)通過無菌水淘洗法減少土壤樣品中容易進(jìn)入水溶液的優(yōu)勢(shì)菌的干擾；2)通過選擇培養(yǎng)基提高分離稀有放線菌的選擇性；3)通過沉淀泥接種法接種純化。詳細(xì)具體的實(shí)施方案如下：

1)無菌水淘洗法步驟是：a)用滅菌三角瓶盛裝土樣少量；b)往三角瓶中倒入冷卻后的無菌水；c)搖晃混勻；d)倒掉上層懸濁液；e)重復(fù)本步驟bcd項(xiàng)數(shù)次。

2)選擇培養(yǎng)基配制步驟是：a)用高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基倒平板；b)用無菌水加重鉻酸鉀配制3％溶液；c)往平板中加入3％重鉻酸鉀溶液100uL后用無菌玻璃涂棒涂布均勻。

3)沉淀泥接種法步驟是：a)將步驟1中第e步剩下的沉淀泥接種于步驟2中第c步制備的平板培養(yǎng)基上；b)用薄膜密封平板口以防培養(yǎng)基干燥；c)將接種密封后的平板放30℃溫箱倒置培養(yǎng)；d)待長(zhǎng)出菌落后挑取菌落轉(zhuǎn)接入新的平板培養(yǎng)基中純化。