[發(fā)明專利]新型完整蛋白質(zhì)微捕集器的制備方法和應(yīng)用

無效

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• 申請(qǐng)日: 2010-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN102030816A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張祥民;關(guān)霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/16
• 分類號(hào): C07K1/16
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型完整蛋白質(zhì)微捕集器的制備及其應(yīng)用。

本發(fā)明制備的完整蛋白質(zhì)微捕集器，可作為兩維在線液相色譜中完整蛋白質(zhì)在兩維之間的切換，對(duì)一維色譜洗脫下來的蛋白質(zhì)進(jìn)行成功地捕集，濃縮及除鹽。該微捕集器在蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中通常有兩種主要的研究方法來分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)，分別是“bottom-up”和“top-down”。?“Bottom-up”指的是“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，該方法在大規(guī)模鑒定未知蛋白質(zhì)方面起著重要的作用。然而，“bottom-up”研究方法提供了完整蛋白質(zhì)非常有限的分子信息。

與bottom-up相比，top-down的技術(shù)方法能夠提供完整蛋白質(zhì)分子水平上的信息，使得我們對(duì)完整蛋白質(zhì)的定量研究及后轉(zhuǎn)移修飾研究成為可能。采用top-down?的技術(shù)路線來研究完整蛋白質(zhì)，在質(zhì)譜鑒定前有效分離捕集全蛋白至關(guān)重要。

相對(duì)于兩維凝膠電泳技術(shù)，由于多維色譜具有自動(dòng)化、多樣性、高通量及高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，采用多維色譜結(jié)合串級(jí)質(zhì)譜來分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。然而，由于缺乏在線捕集完整蛋白質(zhì)的技術(shù)，多維液相色譜分離的樣品大多采用離線濃縮的方式，系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

目前商品化的捕集柱主要用于對(duì)肽段或其它小分子如痕量環(huán)境污染物，藥物或生物體液中代謝物等的富集。富集完整蛋白質(zhì)的捕集柱很少見報(bào)道。用捕集肽段的顆粒固定化整體柱進(jìn)行蛋白質(zhì)捕集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：部分蛋白質(zhì)回收率很低，在20%以下。低的回收率是由于這種捕集柱中顆粒表面涂覆有厚厚的溶膠凝膠涂層造成的。與肽段等小分子相比，捕集全蛋白存在著許多困難：蛋白質(zhì)比肽段復(fù)雜得多，蛋白質(zhì)帶有不同的電荷，存在著各種二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊，還包括多種后修飾。肽段與小分子相似，它們擴(kuò)散進(jìn)出固定相表面的孔隙比較容易。而這種帶有厚厚溶膠凝膠涂層的捕集柱中，固定相表面包覆著多層溶膠凝膠，蛋白質(zhì)分子很難自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)出固定相表面的孔隙中，與固定相進(jìn)行交換平衡。因此發(fā)展一種簡(jiǎn)單便捷而又有效的捕集蛋白質(zhì)的方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重要方面。

為了對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行有效地捕集并獲得高的回收率,微型全蛋白捕集器在結(jié)構(gòu)上應(yīng)具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：首先，捕集器內(nèi)部固定相顆粒表面的溶膠凝膠涂層一定要薄。包覆在顆粒表面的膜越薄，蛋白質(zhì)越容易擴(kuò)散進(jìn)出顆粒表面的孔中，傳質(zhì)效率越高。同時(shí)，微捕集器的機(jī)械強(qiáng)度不能下降。其次，溶膠凝膠網(wǎng)絡(luò)骨架上的通孔要足夠大以保證蛋白質(zhì)自由地通過溶膠凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)。因此，制備一種溶膠凝膠涂層薄，同時(shí)機(jī)械強(qiáng)度高的全蛋白微捕集器成為成功捕集蛋白質(zhì)的關(guān)鍵。

目前,商品化的色譜填料都經(jīng)過了封端處理，以消除硅羥基的存在，以免造成分離時(shí)堿性化合物的色譜峰拖尾。由于硅羥基大量被封閉掉，在進(jìn)行溶膠凝膠反應(yīng)時(shí)，填料很難與水解后的前驅(qū)體反應(yīng)形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，得到的微捕集器機(jī)械強(qiáng)度很差，填料非常容易被沖散。因此在制備前，要對(duì)商品化的色譜填料進(jìn)行活化處理。

本發(fā)明制備了新型薄層溶膠凝膠涂覆的整體型C4，C8和C18微捕集器。利用該微捕集器用于在線多維色譜之間的樣品切換，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及實(shí)際蛋白質(zhì)進(jìn)行了捕集，濃縮，除鹽，從而避免了在后續(xù)質(zhì)譜鑒定中高鹽存在對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的干擾。該全蛋白微捕集器在蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容???????????????????????????????????????????????

本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡(jiǎn)單、溶膠凝膠涂層薄、機(jī)械強(qiáng)度高、壽命長、捕集量高的完整蛋白質(zhì)微捕集器的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提出的完整蛋白質(zhì)微捕集器的制備方法，首先對(duì)商品化的色譜填料進(jìn)行活化處理。目前商品化的色譜填料都經(jīng)過了封端處理，以消除硅羥基的存在，以免造成分離時(shí)堿性化合物的色譜峰拖尾。由于硅羥基大量被封閉掉，在進(jìn)行溶膠凝膠反應(yīng)時(shí)，填料很難與水解后的前驅(qū)體反應(yīng)形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，得到的微捕集器機(jī)械強(qiáng)度很差，填料非常容易被沖散。因此在制備微捕集器前，要對(duì)商品化的色譜填料進(jìn)行活化處理。首先采用氫氧化鈉溶液分別浸泡處理C4，C8和C18反相色譜填料，以活化表面封端的填料，增加固定相表面裸露的硅羥基數(shù)目。將處理后的填料懸浮于以甲基三乙氧基硅烷為前驅(qū)體的溶膠溶液中，由加壓裝置將懸浮液引入到毛細(xì)管中適當(dāng)長度，經(jīng)前軀體的水解和縮聚制得具有三維網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)的完整蛋白質(zhì)微捕集器。處理后的C4，?C8和C18填料都被成功制得了適用于對(duì)完整蛋白質(zhì)捕集的微捕集器。