[發明專利]輔助底物耦聯提高重組菌不對稱轉化(R)-苯基乙二醇效率的方法

有效

• 申請號: 201010534411.0
• 申請日: 2010-11-08
• 公開（公告）號: CN101985647A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 徐巖;張榮珍;王珊珊
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種利用重組菌CCTCC?NO：M?209289不對稱轉化制備(R)-苯基乙二醇效率的方法，其特征在于以2-羥基苯乙酮為底物，進行不對稱轉化反應：在0.1?mol/L、pH?8.0~9.0的Tris-HCl緩沖液中，底物2-羥基苯乙酮濃度為5~10?mg/mL，添加占反應體系總質量6%~10%的甘油和/或6%~10%的異丙醇，然后：

釆用重組菌全細胞生物轉化：添加重組菌CCTCC?NO：M?209289細胞濃度為0.1?g/mL，混勻后于30℃反應1.5-48?h，反應過程中不需要加入輔酶，產物為(R)-苯基乙二醇；

或釆用重組菌CCTCC?NO：M?209289的細胞破碎后經純化后的重組蛋白生物轉化：重組蛋白濃度為1~2?μg/mL，再加5?mmol/L輔酶NADH，混勻后于30℃反應8?h，產物中(R)-苯基乙二醇純度達80%以上。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于重組菌CCTCC?NO：M?209289的培養

LB培養基以g/L計：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl?10，用去離子水配制，pH?7.0；固體培養基再添加占培養基總質量1.5%的瓊脂粉；

培養條件：挑取重組菌株CCTCC?NO：M209289的單菌落接種于4?mL含100?μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37℃，200?rpm振蕩培養過夜，取1?mL培養液轉接于100?mL含100?μg/mL?氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37℃，200?rpm振蕩培養至OD₆₀₀為0.6～0.8，溫度轉為30℃誘導培養過夜，8,000?g離心10?min，用生理鹽水對沉淀所得菌體洗滌2次，收集重組菌細胞。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于重組蛋白的純化：

菌體收集：將收集的重組菌細胞用MCAC-0緩沖液重懸，300?W超聲破碎：工作時間4?s，間歇時間?6?s，共20?min；破碎液16,000?rpm?離心40?min；棄沉淀，取上清進行后續的蛋白純化工作；

蛋白純化：先將上清掛Pharmacia公司的Ni柱兩遍，用MCAC-50緩沖液洗脫雜蛋白，用MCAC-200緩沖液洗脫目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱進行蛋白脫鹽：利用Pharmacia公司的??KTA?蛋白純化系統將蛋白溶液換為無鹽的緩沖液；接著用Pharmacia公司的Resource?Q陰離子交換柱，1×1?cm，進行蛋白純化；最后用Pharmacia公司的Superdex?200，HiLoad?26/60，進行蛋白純化；經SDS-PAGE檢測目的蛋白純度達到90％以上。