[發明專利]eEF-1α作為一種新的水稻內參蛋白質及其抗體的應用

無效

• 申請號: 201010531871.8
• 申請日: 2010-11-04
• 公開（公告）號: CN102464707A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 劉國振;李曉明;李莉云;劉麗娟;韋漢福;潘秦;吳琳;劉斯奇
• 申請（專利權）人: 北京華大蛋白質研發中心有限公司
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C07K16/18;G01N33/68
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技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及eEF-1ot作為一種水稻免疫印跡研究的內參蛋白質及其相應的抗體的應用。

背景技術

看家基因是指在生物體內廣泛表達的必需基因，這些基因大多負責基礎代謝過程，它們往往呈組成型表達，所以在進行表達量的相對比較時被作為內參基因。在生物學實驗中，為了對不同樣本進行比較，需要選擇合適的內參基因進行樣品和實驗過程的校正和標準化，以便得到可靠的實驗結果，所以內參基因的選擇和使用具有重要意義。理想的內參基因應在各種實驗條件下、在各種類型的組織或細胞中恒定表達。然而，大量的實驗結果表明，內參基因的恒定表達都是“有范圍”的，在超出范圍的實驗條件下可能是不適合作為內參的，內參基因使用不當，可能使基因表達的微小差異難以發現，甚至可能引致錯誤甚至相反的結論，所以對內參基因的進行篩選和評價，確定合適的使用范圍是實驗設計時應注意的問題。在動物轉錄水平研究中適合不同物種的內參基因被篩選出來：人、鼠、牛、狗、馬及海豚。在植物的RT-PCR分析中，適合不同物種的內參基因也被篩選出來：擬南芥、小麥、大麥、大豆、番茄、馬鈴薯、白楊、葡萄、桃、咖啡樹及甘蔗。

水稻(Oryza?sativa?L.)是世界上最重要的糧食作物之一，也是植物生長發育、逆境反應等基礎研究的模式植物。水稻基因組測序工作的成果極大地推動了水稻相關研究的進展，帶動了水稻轉錄組學研究，利用水稻全基因組基因芯片調查了水稻在雜種優勢、逆境、發育過程中的表達譜，對特定目標基因的轉錄研究也經常使用RT-PCR技術，在RT-PCR中，篩選并提出了適合水稻的內參基因：eEF-1α和UBQ5(全稱)。水稻基因組學的成果也推動了蛋白質組學的研究，利用2DE-MASS技術對水稻發育、逆境、愈傷組織分化等進行蛋白質組學分析，鑒別了一系列的差異表達蛋白質，同時，隨著水稻功能基因組學工作的開展，對水稻蛋白質功能的驗證和比較研究也日益增加，蛋白質印跡(Western?blotting，WB)技術因具有靈敏度高、特異性好、操作簡便、結果直觀等優點而被廣泛應用于檢測蛋白質在不同組織中的表達水平。顯然，在WB技術中需要使用內參來標定上樣量從以降低實驗誤差。然而有關醫學和動物蛋白水平的定量研究中對內參蛋白質的研究表明，實際上常用的內參如Actin，GAPDH，Tubulin在蛋白水平的表達并不穩定，這就不可避免的影響對特定蛋白質功能研究的精確性，因此有必要篩選出適合水稻蛋白水平研究的內參蛋白質。在水稻中并沒有系統的內參蛋白質篩選和鑒定工作的相關報道。為此，本發明制備了9個水稻候選內參蛋白質的抗體，比較了相應蛋白質在水稻不同發育時期/部位的表達，發現eEF-1α蛋白質在參試條件下表現穩定性優于Actin、GAPDH和Tubulin等，更適合于作為水稻蛋白質研究的內參，進一步研究發現eEF-1α的蛋白水平在白葉枯病抗性反應中和晝夜生長過程中也沒有發生變化，證明了eEF-1α的穩定性。在此基礎上調查了eEF-1α蛋白質在水稻總蛋白中的百分含量以及其檢測的靈敏度，所制備的抗體可供水稻蛋白質相關定性定量研究采用。

發明內容

本發明的目的是提供一種適合水稻免疫印跡研究的新的內參蛋白質eEF-1α及其相應的多克隆抗體。

本發明的第一個目的是提供一種適合水稻免疫印跡研究的內參蛋白質，用不同水稻組織蛋白質進行的免疫印跡實驗證明，eEF-1α(英文全稱為Elongation?factor?1-alpha)蛋白質在水稻不同發育時期和不同組織的材料中表達穩定，進一步研究發現eEF-1α蛋白質在水稻接種白葉枯病菌不同時間的材料和水稻晝夜不同時間的材料中同樣穩定表達，證明了eEF-1α的穩定性，是一種良好的內參蛋白質。

本發明的第二個目的是提供相應的eEF-1α多克隆抗體，以原核表達的重組抗原eEF-1α為免疫原免疫新西蘭大白兔，取其血清測效價達到100000，收集血清，離心后抗原親和純化經檢測得到特異性好、敏感性強的多克隆抗體。

本發明的第三個目的是提供該抗體在水稻及其它植物研究中的用途，包括免疫印跡、蛋白質定量、免疫共沉淀、免疫組化及其它基于抗原抗體反應的應用。