[發明專利]一種以SOX2蛋白表達水平作為前列腺癌惡性程度判斷的方法

無效

• 申請號: 201010531641.1
• 申請日: 2010-11-04
• 公開（公告）號: CN101995474A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 李娜;向榮;賈現培;李雪霏;牟雯君;張舒;呂丹;劉艷華;劉寅
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/28;G01N1/31
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技術領域

本發明屬于一種醫學診斷用的方法，具體的說是一種通過檢測前列腺癌組織中SOX2蛋白的表達情況來判斷前列腺癌惡性程度的方法，該方法是通過免疫檢測技術實現的，屬于臨床免疫診斷方法，特別是運用免疫組化方法檢測SOX2蛋白從而判斷前列腺癌惡性程度的方法。

背景技術

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，位于歐美國家男性腫瘤致死率第二位，僅次于肺癌。近幾年，在我國的發病率呈上升趨勢。前列腺癌的預后與發現早晚、病理類型、患者年齡，及相應的治療措施是否得當密切相關。癌細胞的分化程度與腫瘤的惡性程度和病人的預后密切相關。病理報告上常用Gleason評分來評價前列腺癌細胞的分化程度。因此，對前列腺癌的惡性程度的早期快速診斷可以對治療及預后判斷產生積極的作用。

SOX2(SRY-Related?HMG-Box?Gene?2)是SOX家族的一個成員，是干細胞的標志性基因之一，存在干細胞的核中，是一種維持干細胞特性的重要的轉錄因子，在維持胚胎干細胞及癌癥干細胞的多能性及自我更新能力方面起到至關重要的作用。SOX2與癌癥干細胞的致癌能力密切相關。因此癌細胞中的SOX2極有可能對癌癥的分化程度進行密切的調節，并有可能成為腫瘤分化程度判斷的標志蛋白。我們通過對127例前列腺癌組織芯片(包括病理分級1-3級，Gleason評分2-10分)的免疫組化染色分析發現SOX2的表達水平隨著病理分級的增高以及Gleason評分的增高而表達水平顯著增高，這表明SOX2可以成為前列腺癌分化程度的標志蛋白，進而為前列癌的預后判斷提供參考。即在前列腺癌組織中SOX2蛋白表達程度越高，其分化程度越低，惡性程度越高。(見表1)

表1.SOX2表達水平與前列腺癌病理分級的關系

本實驗以SOX2陽性細胞數占組織細胞的百分比作為陰性及陽性結果的判斷，即＜10％為陰性(-)，而≥10％并＜30％為弱陽性(+)，≥30％并＜50％為中陽性(++)，≥50％為強陽性(+++)。結果表明SOX2的表達水平隨著病理分級的增高以及Gleason評分的增高而表達水平增高，χ²檢驗分析顯示兩者之間均存在顯著相關性。

發明內容

針對上述情況，本發明通過免疫組化的方法檢測病理組織中的SOX2蛋白，以此判斷前列腺癌的分化程度。具體的講就是，通過對病理組織的免疫組化反應，檢測該組織中SOX2分子的表達數量，根據免疫組化反應的結果來判斷前列腺癌的分化程度。

其技術內容包括：免疫組化反應和顯微鏡觀察等步驟。

本發明是通過以下技術方案實現的：

1.脫蠟和水化：

具體步驟如下：

①組織切片置于二甲苯I中浸泡10分鐘，

②組織切片置于二甲苯II浸泡10分鐘，

③組織切片置于無水乙醇中I浸泡10分鐘，

④組織切片置于無水乙醇II浸泡10分鐘，

⑤組織切片置于95％乙醇中浸泡10分鐘，

⑥組織切片置于80％乙醇中浸泡10分鐘，

⑦組織切片置于自來水中浸泡1分鐘，

⑧組織切片置于蒸餾水中浸泡5分鐘。

2.抗原修復，將10mM的Citrate?Buffer(pH?6.0)通過微波爐，加熱10分鐘，放入組織切片中低火加熱10-15分鐘，在室溫下晾涼。

3.用超純水洗處理過的組織切片3次，每次五分鐘。

4.將3％雙氧水溶液滴加在載玻片上，室溫靜置10分鐘，甩去多余液體。

5.用超純水洗2次，各五分鐘

6.滴加封閉液(正常山羊血清，5％BSA溶液)，在室溫下孵育一小時，甩去多余液體。

7.滴加一抗(1∶100)50μL，室溫靜置1小時。

8.TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。

9.滴加二抗(1∶100)50μL，室溫靜置0.5小時。

10.TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘。

11.滴加三抗(1∶100)50μL，室溫靜置0.5小時。

12.TBST緩沖液洗4次，每次5分鐘。

13.DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，在達到滿意效果后放入清水中終止染色，后用自來水沖洗10分鐘。

14.蘇木精復染20秒，自來水沖洗10分鐘。

15.脫水、透明：

具體步驟如下：

①組織切片置于80％乙醇中浸泡30秒，

②95％乙醇中浸泡3分鐘，

③無水乙醇中II浸泡5分鐘，