[發(fā)明專利]亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010529195.0 | 申請日： | 2010-10-28 |
| 公開（公告）號： | CN101974553A | 公開（公告）日： | 2011-02-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 鄭易之;李冉輝;劉國寶;劉昀;鄒永東 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12N15/62;C07K19/00;C07K14/47;C07K1/22;G01N21/64 |
| 代理公司： | 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司 44101 | 代理人： | 宋湘紅 |
| 地址： | 518060 廣東省深圳市南山區(qū)*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 亨廷頓病 相關(guān) 蛋白 polyq 體外 聚集 模型 建立 方法 | ||
1.一種亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于包括如下順序的步驟：
(1)構(gòu)建GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體：所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白是在polyQ多肽序列的N端加有GST標(biāo)簽，polyQ長度為Q36-Q55，所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體是包含有編碼GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白的核苷酸序列的表達(dá)載體；
(2)所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體在表達(dá)菌BL21star中表達(dá)GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；
(3)將上一步所得表達(dá)產(chǎn)物通過親和層析純化獲得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；
(4)將GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST標(biāo)簽，獲得polyQ多肽，冷凍干燥；
(5)制備polyQ多肽溶液：向polyQ多肽凍干粉中加入六氟異丙醇和三氟乙酸混合液，溶解polyQ多肽，然后用氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，再加入pH值為3的三氟乙酸或二甲基亞砜，使polyQ多肽重新溶解，獲得polyQ多肽溶液；
(6)將polyQ多肽溶液在pH6.5-7.8的磷酸鹽緩沖液中或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液中進(jìn)行聚集反應(yīng)，使用硫代黃素T檢測其聚集過程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：以包含有編碼EGFP-polyQ(Q36-Q55)蛋白的核苷酸序列的大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a/EGFP-polyQ(Q36-Q55)為模板，利用PCR方法擴(kuò)增polyQ(Q36-Q55)基因片段，切膠純化基因片段，并進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切后，接至經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-5X-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體；在上述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的引物是，
上游引物F：5’-atgggatccagtccttccagcagcag-3’，
下游引物R：5’-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于：所述polyQ的長度為Q42。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于：所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表達(dá)載體為pGEX-5X/Q42質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于所述pGEX-5X/Q42質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：以包含有編碼EGFP-polyQ(Q42)蛋白的核苷酸序列的大腸桿菌重組質(zhì)粒pET28a/EGFP-polyQ(Q42)為模板，利用PCR方法擴(kuò)增Q42基因片段，切膠純化基因片段，并進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切后，接至經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-5X-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得pGEX-5X/Q42質(zhì)粒；在上述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的引物是，
上游引物F：5’-atgggatccagtccttccagcagcag-3’，
下游引物R：5’-ctcgaattccggtggttactgttgctg-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亨廷頓病相關(guān)蛋白polyQ的體外聚集模型的建立方法，其特征在于：所述酶切去除GST標(biāo)簽的蛋白酶選用胰酶、凝血酶或PreScission。
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