[發明專利]檢測A亞群禽白血病病毒的環介導等溫擴增反應引物

有效

• 申請號: 201010528610.0
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101988131A
• 公開（公告）日: 2011-03-23
• 發明（設計）人: 王笑梅;王永強;高玉龍;高宏雷;秦立廷;祁小樂
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

技術領域

本發明涉及一種檢測動物疾病的引物，尤其涉及用于檢測A亞群禽白血病病毒的環介導等溫擴增反應(LAMP)的特異性引物，屬于A亞群禽白血病的檢測領域。

背景技術

禽白血病是由禽白血病病毒(avian?leukosis?virus，ALV)引起的以多種腫瘤發生為特點的免疫抑制性疾病。

目前，由于我國對禽白血病的凈化缺乏有效的措施和完善的體系，由禽白血病病毒感染或禽白血病病毒與其它禽免疫抑制病病毒混合感染造成的疾病暴發或免疫抑制時有發生，近兩年來，該病的感染情況越發嚴重，給養禽業造成了巨大的經濟損失。

根據病毒中和試驗、病毒干擾試驗及囊膜蛋白基因序列，可將ALV分為多個亞群。其中，雞ALV包括外源性的A、B、C、D、J亞群和內源性的E亞群。經典ALV-A以淋巴細胞瘤為主，還有多種其他類型的細胞瘤，包括血管瘤。A亞群曾被認為是商業產蛋雞群中(尤其是來航雞)最普遍的外源性病毒亞群。近年來也有A亞群感染的報道，喬彥華等從2006年采集自北京的雞場病料中分離到一株A亞群禽白血病；何愛飛等報道了2008年在貴陽市烏當區某商品蛋雞群發生了A亞群禽白血病病毒引起的血管瘤型禽白血病。Zhang等在進口的肉用種雞中分離到一株A亞群病毒。此外，有報道A亞群與其它亞群共感染的現象。Fenton等發現A、J亞群能夠感染同一只雞。Spencer等從商品蛋雞群中同時檢測到ALV-A和ALV-B，這種共感染為病毒亞群間重組提供了可能。Lupiani等分離到三株J/A重組病毒。近年來，馬立克疫苗被A亞群禽白血病污染的事件時有報道。這再一次引起了研究人員對A亞群的關注，因此對A亞群的分型檢測就顯得十分必要。LAMP技術以其特有的優勢，自2000年被發明以來，受到了各研究領域的極大關注。

LAMP技術是一種依賴Bst聚合酶特性以成環擴增為核心的核酸擴增技術。該技術由于需要4(或6)條引物，對6(或8)個特定的區域進行識別，因而特異性強。對LAMP技術來說，引物設計是其核心。同時，對于禽白血病病毒的分型檢測來說，實現分型的關鍵也在于引物。

發明內容

本發明的目的是提供一組用于禽白血病病毒的分型檢測的LAMP引物；

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明通過對禽白血病病毒各亞群基因組的比對，選取禽白血病病毒gp85區段作為LAMP引物設計區域，篩選出一組擴增效率良好的引物，其中，所述引物由一對外引物、一對內引物和一對環引物所組成，其中，外引物由SEQ?ID?NO.1(F3)和SEQ?ID?NO.2(B3)組成；內引物由SEQ?ID?NO.3(FIP)和SEQ?ID?NO.4(BIP)組成；環引物由SEQ?ID?NO.5(LF)和SEQ?ID?NO.6(LB)組成。

在本發明所設計的LAMP引物的基礎上，本發明成功建立了A亞群禽白血病病毒的分型LAMP檢測方法，由于設計了一對環引物，極大的加速了反應的進程，縮短了反應所需的時間，能夠在45min內檢出20個拷貝的病毒核酸，比常規PCR敏感100倍(Blomstrom?etal.，2008；Endo?et?al.，2004；Mao?et?al.，2008；Nagamine?et?al.，2001；Yoneyama?et?al.，2007；Zhang?et?al.，2009)。

本發明所建立的A亞群禽白血病的LAMP檢測方法能夠成功地將A亞群病毒與J亞群、B亞群、C亞群、E亞群病毒相區分，同時也不與其它常見的禽類傳染病發生非特異性反應。敏感性試驗表明該方法能夠在45分鐘內檢測出20個拷貝的病毒核酸，比常規PCR敏感100倍。實現了對A亞群的快速檢測，而且其結果可通過顏色變化進行判定。整個反應過程不需要開蓋，極大地減少了污染的可能性，具有現地應用的前景。

總之，本發明所建立的ALV-A?LAMP檢測方法準確性高、靈敏度高、特異性強。