[發明專利]一種大豆葉片特異性啟動子SRS4及其應用

無效

• 申請號: 201010526255.3
• 申請日: 2010-11-01
• 公開（公告）號: CN101979563A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發明（設計）人: 李海燕;崔喜艷;劉曉慶;張林波;陳展宇;宋慧
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 長春市四環專利事務所 22103
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬生物技術領域，確切地說是大豆葉片光控基因SRS4啟動子及其在轉基因植物中的應用。

背景技術

大豆為蝶形花科大豆屬一年生草本植物，種子含有豐富的蛋白質，原產我國，至今已有5000年的種植史。大豆不僅是重要的食用油脂和蛋白食品原料，而且是飼養業重要的蛋白飼料來源，是我國重要的糧油作物之一。

我國是大豆生產大國，但由于我國大豆種植面積減少及食用油消費量的不斷增長和養殖業發展對豆粕需求的增加，導致我國大豆需求量迅速增加，如今我國也成為世界最大的大豆凈進口國。

目前，利用傳統育種，改良栽培等方法提高大豆產量已陷入瓶頸；因此，利用基因工程來獲得優質高產和穩產大豆是我國的當務之急。

植物基因工程研究的主要內容是基因的表達和調控，但外源基因表達量不足是不能獲得理想轉基因植物的重要原因。啟動子在決定基因表達方面起著關鍵作用，因此選擇合適的植物啟動子是增強外源基因表達的首要問題。

組成型啟動子在轉基因植物應用中暴露出一些問題，如：外源基因在整株植物中表達，產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累，打破了植物原有的代謝平衡；有些產物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡。因此，人們必需尋找特異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調控外源基因表達。

1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，是光合植物葉片中含量最豐富的蛋白質，約占可溶性總蛋白的50％；也是光合作用中的關鍵酶。Rubisco由8個大亞基(rbcL)和8個小亞基(rbcS)組成，其中由核基因編碼的小亞基基因的表達受光調控，并具有組織特異性。

發明內容

本發明的目的是提供一種大豆葉片特異性啟動子SRS4。

一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，它的堿基序列如SEQ?ID?No.1所示；

它是以大豆“吉農13”基因組DNA為模板，以

SS：5`-GTGGATGACTCAAGTGCTGG-3`SA：5`-TCATTGAGGAAGCCATTTGC-3`為引物，通過PCR方法擴增獲得。

一種含有堿基序列為SEQ?ID?No.1基因的植物表達載體。

本發明另一個目的是，一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，在轉基因植物中的應用，特別是轉基因大豆中的應用。

本發明一種大豆葉片特異性啟動子SRS4，是用本發明人獨特發計的引物，以大豆“吉農13”基因組DNA為模板，采用TAIL-PCR克隆了大豆rbcS基因SRS4啟動子5`側翼，根據TAIL-PCR所得序列和已知序列設計特異引物，克隆大豆rbcS基因SRS4啟動子，并構建其植物表達載體，用農桿菌介導的煙草遺傳轉化，表達GUS基因的方式進行篩選，篩出一種葉片特異性光控啟動子SRS4。

1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)存在于所有高等植物中，具有雙重功能，既能催化RuBP與CO₂形成3-磷酸甘油酸的反應，又能催化RuBP與O₂氧化裂解形成3-磷酸甘油酸、磷酸和磷酸乙醇酸的加氧反應；因此，RuBP羧化酶是處于光合碳還原和光合碳氧化兩個相反方向但又相互連鎖的循環交叉點上，它的含量和活性變化對植物凈光合效率起著決定性作用；為建立植物轉基因表達的時、空、量三維調控系統奠定理論基礎；對研究基因表達調控、構建基因工程載體、表達目的蛋白、提高產量有著重要的意義。

附圖說明

圖1為TAIL-PCR產物的電泳分析，M：DL2000；1，2，3泳道：AD2和特異引物組合所得的第1，2，3輪PCR產物；

圖2為大豆rbcS啟動子SRS4的電泳分析，M：DL2000；1：大豆rbcS啟動子的PCR產物。

圖3為重組質粒的PCR及酶切鑒定，M：DL2000，1：重組質粒的PCR鑒定，2：重組質粒的雙酶切鑒定。

具體實施方式

實施例1??提取大豆“吉農13”基因組DNA

將大豆“吉農13”種子播在裝好砂的營養缽中，放在RXZ型智能人工氣候培養箱中培養。種子出芽前采用暗培養，出芽后采用Hoagland營養液培養，白天25℃，黑夜16℃，光照16h/d，光強3000lx，相對濕度75％；取生長2周的大豆幼苗嫩葉，按照AxyPrep基因組DNA小量提取試劑盒進行，提取大豆“吉農13”基因組DNA；