[發(fā)明專利]革囊星蟲纖溶酶及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010525002.4
• 申請日: 2010-10-29
• 公開（公告）號: CN102002488A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 廖共山;雷丹青;唐景財(cái);李肖肖
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 翁建華

1.一種革囊星蟲纖溶酶，其特征是革囊星蟲纖溶酶從新鮮革囊星蟲的體腔液和內(nèi)臟組織提取，其物化性能為：同時(shí)具有直接溶解纖維蛋白及激酶的雙重活性；其分子量在28000-32000之間，等電點(diǎn)在4.6-6.6之間，纖維蛋白溶解活性在30～70℃溫度范圍下活性變化不大，對pH值的穩(wěn)定范圍在5.0～9.0。

2.如權(quán)利要求1所述的革囊星蟲纖溶酶，其特征是纖維蛋白溶解活性最適溫度為40℃，最適pH值為8.0。

3.一種革囊星蟲纖溶酶的制備方法，其特征是步驟為：

第一步，采用生化層析方法提取純化從革囊星蟲獲得纖溶酶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定純度，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)；

第二步，應(yīng)用纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性及其纖溶性質(zhì)鑒定，測定熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性；

第三步，體外血凝塊溶解試驗(yàn)及小鼠皮下出血毒性試驗(yàn)。

4.如權(quán)利要求3所述的革囊星蟲纖溶酶的制備方法，其特征是制備工藝為：

a.革囊星蟲纖溶酶的分離和提?。?/p>

新鮮革囊星蟲洗凈，取體腔液和內(nèi)臟組織，按比例加入預(yù)冷的pH6.5～8緩沖液，高速勻漿，離心，取上清液，選擇分子量分離范圍在2.7～3.5萬的凝膠過濾填料和在pH6.5～8范圍內(nèi)能吸附革囊星蟲纖溶酶的陰離子交換填料進(jìn)行層析分離，收集具有纖溶酶活性的組分；通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純度和分子量，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)；

b.用纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性及其纖溶性質(zhì)鑒定：以尿激酶為對照品，纖維蛋白平板法測定纖溶酶活性與活力；分別將尿激酶和純化的纖溶酶加到加熱和不加熱纖維蛋白平板中測定纖溶酶活性，在4℃～80℃范圍測定溫度對纖溶酶穩(wěn)定性和活力的影響以及最適溫度；在pH3～12范圍測定pH對纖溶酶穩(wěn)定性和活力的影響以及最適pH；

c.體外血凝塊溶解試驗(yàn)：從兔子頸總動(dòng)脈取血，體外制備血凝塊稱重后放入編號的試管中，加入生理鹽水和不同活力的纖溶酶溶液(1000U、500U、250U)及1000U尿激酶，置37℃水浴保溫24h后取出稱重，計(jì)算血凝塊的溶解率；

小鼠皮下出血毒性試驗(yàn)：在小鼠背部皮下注射革囊星蟲纖溶酶0.1ml/點(diǎn)，24小時(shí)后剝皮觀察皮下是否出現(xiàn)瘀血斑；注射前革囊星蟲纖溶酶用生理鹽水稀釋成500U/ml；

d.結(jié)果評定：

本發(fā)明的革囊星蟲纖溶酶，在加熱板上和不加熱板上都有纖維蛋白溶解圈，不加熱板上溶解圈大于加熱板，尿激酶僅在不加熱板上有纖維蛋白溶解圈；由此證實(shí)此蛋白酶同時(shí)具有直接溶解纖維蛋白及激酶的雙重活性；其分子量在28000-32000之間，等電點(diǎn)在4.6-6.6之間，此纖溶酶的纖維蛋白溶解活性在30～70℃溫度范圍下活性變化不大，最適溫度為40℃；其對pH值的穩(wěn)定范圍為5.0～9.0，最適pH值為8.0。