[發明專利]一種固氮螺菌的發酵方法與由該方法得到的發酵液及其用途

有效

• 申請號: 201010514882.5
• 申請日: 2010-10-22
• 公開（公告）號: CN101967461A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 朱瑞艷;殷光;崔曉燦;徐志文
• 申請（專利權）人: 秦皇島領先科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C05F11/08;C12R1/01
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 田燕

1.一種固氮螺菌的發酵方法，其特征在于該方法包括下述步驟：

A)菌種活化

LB固體培養基的制備：分別稱取氯化鈉、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸餾水或自來水溶解，得到以重量百分數表示的0.8-1.2％氯化鈉、0.4-0.6％酵母浸粉、0.8-1.2％蛋白胨，用無機械或無機酸將該溶液的pH調節至6.8-7.0，然后加入1.6-2.4％瓊脂粉，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘后，再放置在室溫下靜置得到LB固體培養基；

把固氮螺菌菌體在所述的LB固體培養基上進行活化，在培養溫度28-32℃下培養至單菌落直徑達到2-3mm；

B)擴大培養

擴大培養的液體培養基的制備：稱取下述原料用蒸餾水或自來水溶解，再用無機堿或無機酸將溶液的pH調節至6.8-7.0，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫得到所述的擴大培養的液體培養基：

以重量百分數表示，0.12-2.0％?C₂-C₄有機酸、0.05-0.15％選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0.05-0.3％選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0.02-0.03％硫酸鎂、0.01-0.1％磷酸鹽和0.001-0.01％選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物；

把步驟A)活化的菌體接入擴大培養的液體培養基中，在溫度28-32℃下振蕩培養至對數生長中期；

C)發酵培養

發酵培養的發酵培養基的制備：稱取下述原料用蒸餾水或自來水溶解，再用無機堿或無機酸將溶液的pH調節至6.8-7.0，再在溫度121℃下高壓滅菌30分鐘，冷卻得到所述的發酵培養的液體培養基：

以重量百分數表示，0.5-2.5％C₂-C₄有機酸、0.1-0.15％選自氯化銨或硫酸銨的無機銨鹽、0.1-0.3％選自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有機氮源、0.02-0.03％硫酸鎂、0.01-0.1％磷酸鹽和0.001-0.01％選自氯化鐵、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、鉬酸鈉或檸檬酸鐵的微量元素化合物；

以所述的發酵培養的液體培養基(以體積計)把3-10％在步驟B)擴大培養的菌體接入發酵罐中，在發酵溫度28-32℃下進行發酵，并且進行如下控制，直至細胞生長進入對數生長后期，終止發酵，并進行平板稀釋涂布計數：

(1)在固氮螺菌細胞生長延滯期：將轉速控制在100-300r/min，溶氧控制在0.3-0.5vvm；

(2)在細胞對數生長期：將轉速控制在200-500r/min，溶氧控制在0.5-0.8vvm；

(3)在發酵培養過程中，根據pH變化進行C₂-C₄有機酸補料，以便保證在發酵過程中碳源濃度處于恒定水平；所述補料液的C₂-C₄有機酸重量百分濃度為20-90％。

2.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于所述的固氮螺菌是以有機酸作為底物的紅螺菌屬和固氮螺菌屬的菌株。

3.根據權利要求1的發酵方法，其特征在于所述的無機堿是NaOH或KOH。

4.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于所述的無機酸是鹽酸或硫酸。

5.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于所述的C₂-C₄有機酸是可以是乙酸、乳酸或蘋果酸。

6.根據權利要求1或5所述的發酵方法，其特征在于所述的C₂-C₄有機酸的重量百分濃度為30-40％。

7.根據權利要求1所述的發酵方法，其特征在于在細胞對數生長期，將轉速控制在450-500r/min，溶氧控制在0.75-0.8vvm。

8.根據權利要求1所述，其特征在于所述的磷酸鹽是磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀，它們的濃度分別為：0.1-2.0g/L和0.4-1.6g/L，并且二者組成非緩沖體系對。

9.采用權利要求1-8權利要求所述發酵方法得到的發酵液，其特征在于它含有的固氮螺菌活菌數為70-120億個/ml。

10.根據權利要求9所述的發酵液在制備固氮微生物肥料中的用途。