[發明專利]聚乙二醇-葡激酶偶聯物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010514551.1
• 申請日: 2010-10-14
• 公開（公告）號: CN102451471A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 蘇志國;馬光輝;王俊;劉永東;胡濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: A61K47/48
• 分類號: A61K47/48;A61K38/16;A61P7/02
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇;楊小蓉

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體地，本發明涉及一種聚乙二醇-葡激酶偶聯物及其制備方法和應用。

背景技術

葡激酶來源于金黃色葡萄球菌，由136個氨基酸組成不含二硫鍵的單鏈，分子量約為15KD(Eur.J.Biochem.1985，149：557-561)。與其他溶栓劑相比，葡激酶具有良好的溶栓特異性，不引起纖維蛋白原和α-抗纖溶酶水平的降低，不易誘發全身性溶血，對富含血小板的動脈血栓具有較強的溶栓能力。由于葡激酶具有上述優良的溶纖性能，成為人們研究和開發的重點。目前葡激酶基因已經分別被克隆到Escherichia?coli，Bacillus?subtilis，和Streptococcus?sanguis中并實現了表達(MGG，1987，210：528-534)。

葡激酶(Sak)是一種非酶類蛋白，本身無酶活性，而是一種輔助因子，它的活化石通過與纖溶酶原結合后能使纖溶酶原(plg)以1∶1的比例結合形成復合物，但此復合物依然沒有活性，而需要通過一系列的變化形成具有活化plg的活性復合物。研究表明，在Sak和plg形成復合物后，Sak的氨基端會去掉10個或6個氨基酸，形成低分子量Sak-plg復合物，同時復合物上的plg轉變為纖溶酶，形成具有高度活性的復合物，進而激活更多的纖溶酶原，從而產生溶栓作用(Curr.Opin.Biotechnol，1994，5(2)：180-186)。血循環中的纖溶酶可因α-抗纖溶酶作用于賴氨酸結合位點和活性中心而迅速失活。當循環血中存在血栓凝塊時，由于纖溶酶上賴氨酸結合位點和活性中心均被親和力較高的血纖維蛋白占據，α-抗纖溶酶僅能使之緩慢失活，這時候纖溶酶就能發揮其溶栓作用。

對葡激酶進行聚乙二醇(PEG)修飾可使其獲得更好的物理和熱穩定性、更強的抗蛋白水解和酶解能力、更好的溶解性、更低的清除率以及更好的藥效等。目前國內外已經有很多相關的研究，主要是把葡激酶的一些賴氨酸位點突變為半胱氨酸，然后用修飾巰基的聚乙二醇修飾劑來修飾，或者直接用非特異性的修飾劑來修飾。這些方法修飾后得到的偶聯物的最大的一個缺點是，偶聯的聚乙二醇大分子阻礙了葡激酶與纖溶酶的結合，使得偶聯物的生物活性相對于原蛋白有很大的下降。

發明內容

本發明是為了解決現有技術中PEG修飾葡激酶造成其生物活性降低的問題而完成的。

本發明的目的是提供一種聚乙二醇-葡激酶偶聯物，所述偶聯物是葡激酶N端連接有聚乙二醇共價偶聯物，其中，通過聚乙二醇修飾劑將聚乙二醇共價連接到葡激酶的N端，所述的聚乙二醇修飾劑優選為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量優選為1000～40000，包括線型和分支型兩種結構，所述的葡激酶優選為重組型的人葡激酶。

本發明的再一目的是提供上述的聚乙二醇-葡激酶偶聯物的應用。

本發明的再一目的是提供上述聚乙二醇-葡激酶偶聯物的制備方法，所述方法包括使用聚乙二醇修飾劑共價修飾葡激酶N末端的步驟，其中，所述的聚乙二醇修飾劑優選為單甲氧基聚乙二醇醛類修飾劑，其分子量優選為1000～40000，包括線型和分支型兩種結構，按摩爾比，葡激酶∶修飾劑為1∶2-10，修飾劑∶還原劑為1∶10-50，進行反應，所述的葡激酶優選為重組型的人葡激酶。

具體的本發明的聚乙二醇-葡激酶偶聯物的制備方法包括以下步驟：

1)將葡激酶用10-50mM?pH4-6的乙酸鈉緩沖液溶解，配制成為0.1-10mg/mL的溶液；

2)按照摩爾比，葡激酶∶修飾劑為1∶2-10，修飾劑∶還原劑為1∶10-50，在4℃-37℃下進行反應0.5-24小時；

3)加入1M甘氨酸終止反應；

4)以Superdex?200對步驟3得到的修飾混合物進行純化，收集聚乙二醇-葡激酶偶聯物，其中，洗脫液為0.05-0.2mol/L磷酸緩沖液(含0.15M?NaCL)，pH6-8。

本發明提供的聚乙二醇-葡激酶偶聯物是利用特異性的PEG醛修飾劑，它能夠特異性的共價修飾葡激酶的N端，由于葡激酶的溶栓作用有其特殊的作用機制，當Sak和plg形成復合物后，Sak的氨基端去掉10個或6個氨基酸，從而才能夠形成具有高活性的復合物，此時特異性連接在Sak氨基端的PEG醛修飾劑也會隨之被切除掉，不會防礙此復合物進一步發揮溶栓作用，影響其生物活性。目前還沒有利用PEG醛類修飾劑對葡激酶進行修飾的報道。因此，本法明的聚乙二醇-葡激酶偶聯物既能夠大幅度的提高其體內的半衰期，同時，還能夠完全保留原蛋白的生物活性，在治療心腦血管疾病藥物的制備中能夠發揮巨大的應用潛力。