[發明專利]一種分離植物或微生物總RNA的試劑組合物及其制備方法

有效

• 申請號: 201010509840.2
• 申請日: 2010-10-15
• 公開（公告）號: CN102443580A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 楊帆;洪霓;王國平;王利平;徐文興;丁芳
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA純化試劑組合物，其特征在于，包括以下組分：

1)溶液A：

a.按重量/體積計異硫氰酸胍50％；

b.醋酸鈉0.1mol/L；

c.氯化鈉0.25mol/L；

d.氯化鎂10mmol/L；

e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0.7％；

f.糖原60μg/ml；

g.按體積/體積計β-巰基乙醇0.5％

2)溶液B：pH4.0-5.0的水飽和酚；

3)裂解液：

a.按體積/體積計，溶液A?50％-55％；

b.按體積/體積計，溶液B?50％-45％；

c.按重量/體積比甲基紅0.2‰；

將溶液A和溶液B按體積比1∶1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液。

2.一種分離柑橘類植物、煙葉或梨腐爛病菌絲體總RNA的方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)、制備RNA純化試劑組合物：

1)溶液A：

a.按重量/體積計異硫氰酸胍50％；

b.醋酸鈉0.1mol/L；

c.氯化鈉0.25mol/L；

d.氯化鎂10mmol/L；

e.按重量/體積計十二烷基肌氨酸鈉0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按體積/體積計β-巰基乙醇0.5％

2)溶液B：pH4.0-5.0的水飽和酚；

3)裂解液：

a.按體積/體積計，溶液A?50％-55％；

b.按體積/體積計，溶液B?50％-45％；

c.按重量/體積比甲基紅0.2‰；

將溶液A和溶液B按體積比1∶1混合后，加入甲基紅使溶液呈玫瑰紅色，即為所述的裂解液；

(2)樣品裂解

根據樣品稱重，按照每0.1g樣品添加1ml裂解液的比例吸取裂解液于離心管中，將樣品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的離心管中劇烈震蕩，樣品勻漿后在室溫下放置5min，然后置于冰上直至所有樣品勻漿完成，不立即進行RNA提取的樣品可將勻漿置于-20℃保存；

(3)抽提

按每1ml裂解液添加200μl氯仿的比例向勻漿中加入氯仿，劇烈震蕩使溶液呈乳濁狀，冰上靜置5min后于4℃下離心，離心后吸取上層水相于新離心管中并加入等體積氯仿再次抽提，離心，除去水相中殘余的酚；

(4)沉降RNA

吸取上層水相于新離心管中，加入等體積異丙醇，冰上至室溫25℃放置10min后，離心回收RNA；

(5)洗滌溶解RNA

在室溫條件下，用濃度為75％的乙醇使RNA沉淀懸浮，洗滌1-2次后，將其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯處理的去離子水中。