[發明專利]用于熒光定量PCR定量檢測的質粒標準品

在審

• 申請號: 201010509523.0
• 申請日: 2010-10-18
• 公開（公告）號: CN102453748A
• 公開（公告）日: 2012-05-16
• 發明（設計）人: 許軍普;陳釗;莫敏俐;李雋
• 申請（專利權）人: 北京雅康博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12N15/63;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及質粒。具體地說，本發明涉及用于熒光定量PCR定量檢測的質粒標準品。

發明背景

熒光定量PCR最早是在1992年由日本科學家Higuchi報告提出的。是指在PCR反應體系中加入熒光基團，它在光刺激下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物的變化，熒光信號變量和擴增產物變量成正比，并用足夠靈敏的自動化儀器實現對熒光的采集和分析，最后通過標準曲線對未知模板進行分析，以達到對原始模板量定量的目的。

在實時熒光PCR中，模板的定量有兩種方法：絕對定量和相對定量兩大種類[Walker?NJ，J?Biochem?Mol?Toxicol，2001，15(3)：121-127]。絕對定量是對未知樣品的絕對量(拷貝數)進行測定的方法；而相對定量，并不是測定基因的絕對量，而是分別測定目的基因和內參基因的量，再根據內參的量對目的基因量進行歸一化處理，最后再進行樣品間相對量的比較。

絕對定量解析方法是使用已知濃度的標準品制作標準曲線，對未知濃度的樣品進行絕對量(拷貝數)測定的方法。所以，絕對量(拷貝數)已知并含有未知樣品序列的標準品是必要的。為了保持與實際檢測樣品間的擴增效率的一致性，標準品應盡量選擇與實際檢測樣品結構近似的樣品。經驗證質粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物。質粒分子的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限穩定量的標準物質，并且純度較高；且操作容易，穩定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，經濟又高效。甚至有學者將質粒標準分子稱為“金標準物質”。

制作標準曲線首先必須準備4-6個梯度稀釋的標準品，然后將這些標準品作為模板進行Real?Time?PCR反應，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板濃度的對數值之間存在的線性關系，就能夠制作出標準曲線。

盡管腫瘤發病的分子機制尚未完全闡明，但相關基因的遺傳學改變的積累是致癌性轉變的根本原因，這一點已得到普遍承認。癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就可出現。熒光定量PCR不但能有效地檢測基因的突變，而且能準確測定表達量，據此進行腫瘤早期診斷，治療和預后判斷。對某些癌基因的遺傳學變化的檢測幾乎達到了確診腫瘤的程度。

本試驗所用熒光定量PCR質粒載體具有以下優點：

1.制作處理過程簡便，實驗周期短，實驗操作易于標準化。

2.價格適中，易于推廣。

3.定量準確，這是本試劑方法最獨特的優點。通過實時熒光PCR擴增曲線參數，定量測定樣本中基因拷貝數。

4.減少人為實驗誤差。

發明內容

本發明要解決的問題是提供可供基因突變檢測、表達量檢測及基因擴增檢測的陽性標準品。

本發明的目的通過以下技術方案得以實現：

(1)構建一種質粒載體，其特征在于包括被檢測的基因序列。

(2)上述(1)所述的質粒載體，其選自TA克隆載體，優選為pMD18-T。

(3)上述(1)所述的質粒載體，被檢測的目的基因被整合到載體中。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。

圖1是本發明實施例2所用質粒對照品構建方法示意圖。

圖2是本發明實施例2質粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入基因PCR產物序列的位置。

圖3是本發明實施例2的野生型質粒標準品測序結果圖，其中圖A是EGFR?18外顯子2155G野生型質粒測序圖，圖B是EGFR19外顯子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型質粒測序圖，圖C是EGFR?21外顯子2573位T野生型質粒測序圖。

圖4是本發明實施例2的突變型質粒標準品測序結果圖，箭頭所指為堿基突變位點。其中圖A是EGFR?18外顯子2155G→A突變質粒測序圖，圖B是EGFR?19外顯子2235-2249位缺失突變質粒測序圖，圖C是EGFR?19外顯子2236-2250位缺失突變質粒測序圖，圖D是EGFR?19外顯子2254-2277位缺失突變質粒測序圖，圖E是EGFR?21外顯子第21外顯子2573位T→G突變質粒測序圖。

圖5是本發明實施例3KRAS野生型質粒測序圖。