[發(fā)明專利]糖核苷酸的酶法制備

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010507653.0
• 申請日: 2010-10-15
• 公開（公告）號: CN102443597A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王鵬;李磊;原靜;王鳳榮
• 申請（專利權(quán)）人: 天津賽科瑞德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/30
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及包括GDP-Fuc、CMP-Sia、UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc在內(nèi)的糖核苷酸的酶法制備方法。?

背景技術(shù)

糖類是生物體內(nèi)最基本的組成部分之一，糖結(jié)構(gòu)的表達(dá)異常是腫瘤表型的標(biāo)志之一。結(jié)構(gòu)均一性糖鏈的獲得是破解它們生物功能謎題的先決條件。人們開發(fā)了多種合成復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)的方法和工藝。這個前沿領(lǐng)域的發(fā)展?為糖鏈功能的測定，糖鏈結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的解析，生物合成途?的闡明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。體外糖合成有兩種常用策略：化學(xué)合成和酶法(包括化學(xué)-酶法)合成。復(fù)雜糖鏈目前依然是有機(jī)化學(xué)合成中具有挑戰(zhàn)性的化合物。?

實(shí)踐檢驗，酶法合成被證明是化學(xué)合成的有效替代途?。與化學(xué)方法相此，酶法合成在更為有效進(jìn)行高度空間和立體化學(xué)特異性的糖基化反應(yīng)方面具有明顯的優(yōu)勢。用于糖合成的酶主要是糖基轉(zhuǎn)移酶。而糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)需要糖核苷酸作為糖基供體。如下圖所示，其中R代表不同的核苷。?

糖核苷酸價格昂貴，如GDP-Fuc的價格為5mg/$594(Sigma)，CMP-Sia的價格為5mg/$189，UDP-GalNAc的價格為5mg/$159。這是由于糖核苷酸極難化學(xué)合成，而如GDP-Fuc等在內(nèi)的糖核苷酸在生物體內(nèi)純在較少，生物提取?接提高了其成本。之前的酶法合成則需要多酶反應(yīng)，也比較復(fù)雜，難以大量合成。如以前GDP-Fuc的酶法合成使用De?novo路線，如下圖，其需要本身就昂貴的GDP-Man作為底物，分兩步反應(yīng)得到GDP-Fuc，而GDP-Man、GDP-Fuc以及其生成的中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)極為相似，造成純化生的困難。其他幾種糖核苷酸如CMP-Sia、UDP-GalNAc的合成也是如此。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供酶法大量制備包括GDP-Fuc在內(nèi)的昂貴糖核苷酸的方法，該方法所使用的是糖核苷酸的Salvage?Pathway路線，如上圖中GDP-Fuc?的Salvage路線。使用本發(fā)明的方法，能夠一價格低廉的單糖作為合成底物，經(jīng)過兩步簡單的生物反應(yīng)，大量制備糖核苷酸。?

本發(fā)明所涉及的糖核苷酸的酶法制備，由下述步驟組成：?

(1).克隆表達(dá)載體的構(gòu)建：?

克隆出FKP使用酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI構(gòu)建入載體pET15b，命名為v-FKP；克隆出NahK使用酶切位點(diǎn)NdeI和XhoI構(gòu)建入載體pET22b，命名為v-NahK；克隆GlmU使用酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI構(gòu)建入載體pET15b，命名為v-GlmU、克隆NmCSS使用酶切位點(diǎn)NdeI和BamHI構(gòu)建入載體pET15b，命名為v-NmCSS；?

(2).酶的過量表達(dá)與純化：?

上述表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌形成表達(dá)特異酶的工程菌株。?陽性克隆工程菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-12小時后轉(zhuǎn)接入新的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時，搖床轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘；當(dāng)方發(fā)酵液濃度達(dá)到OD₆₀₀＝0.6-0.8時，加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)20小時，溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘；菌體通過離心收集，經(jīng)過細(xì)胞破碎后使用親和層析純化目的蛋白；?

其中LB培養(yǎng)基的配方為：10g/L蛋白胨；5g/L酵母粉；10g/L氯化鈉；?

其中親和層析使用鎳離子親和樹脂；純化使用平衡緩沖液為20mM?Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化鈉，5mM4咪唑；清洗緩沖液為20mM?Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化鈉，25mM咪唑；洗脫緩沖液為20mM?Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化鈉，250mM咪唑；?

(3).糖核苷酸GDP-Fuc的酶法制備與純化?

以等物質(zhì)的量的L-巖藻糖、ATP、GTP為底物，反應(yīng)液中加入終濃度為20mM的氯化鎂和每克反應(yīng)10個單位的焦磷酸水解酶，反應(yīng)在GDP-Fuc合成酶FKP的作用下進(jìn)行，使用薄板層析檢測反應(yīng)的進(jìn)度；待反應(yīng)完成后，?反應(yīng)液與活性炭混合，使用10體積的水和20體積的10％的乙醇洗滌，然后使用含有5％氨水的35％乙醇洗脫；洗脫液經(jīng)濃縮并真空抽去氨水和乙醇后進(jìn)行離子交換純化，最后使用氯化鈉溶液洗脫；得到的溶液使用活性炭除鹽。?

(4).糖核苷酸CMP-Sia的酶法制備與純化?