[發(fā)明專利]利用生物反應(yīng)器快速膨大培養(yǎng)百合脫毒籽球的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010506266.5
• 申請(qǐng)日: 2010-10-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102440184A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王文和;趙祥云;徐佳;安利清;楊柳;王建立
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王文和;趙祥云;徐佳
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開(kāi)了利用鼓泡式生物反應(yīng)器快速膨大切花百合脫毒小鱗莖(籽球)的培養(yǎng)方法，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域和植物細(xì)胞工程的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

百合是重要的觀賞花卉，主要用于切花品種生產(chǎn)。百合在開(kāi)放環(huán)境條件下，不可避免地要被病毒侵染，病毒侵染所造成的百合農(nóng)藝性狀退化嚴(yán)重，極大地影響了百合的生產(chǎn)。種植百合脫毒種球是百合花卉生產(chǎn)的最重要的環(huán)節(jié)，近年來(lái)我國(guó)百合的消費(fèi)量逐年增大，現(xiàn)在我國(guó)百合生產(chǎn)將近90％以上的脫毒種球依賴進(jìn)口。百合脫毒技術(shù)是利用人工組培方法脫除百合外植體所感染的病毒，并進(jìn)行無(wú)病毒培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)繁殖實(shí)現(xiàn)無(wú)病毒籽球的快速繁育的技術(shù)。我國(guó)百合脫毒技術(shù)在生產(chǎn)上絕大多數(shù)采用傳統(tǒng)組培方式生產(chǎn)脫毒籽球，在生產(chǎn)過(guò)程中采用固體培養(yǎng)基完成組培過(guò)程的培養(yǎng)，其中脫毒籽球膨大培養(yǎng)是限制生產(chǎn)規(guī)模和速度的環(huán)節(jié)之一。采用傳統(tǒng)組培方法這一過(guò)程需要將培養(yǎng)物置于固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行表面培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用效率低；在調(diào)整培養(yǎng)基成分時(shí)需要大量的人力進(jìn)行轉(zhuǎn)接；培養(yǎng)時(shí)間要長(zhǎng)達(dá)2-3個(gè)月的時(shí)間；生產(chǎn)過(guò)程需要很大的培養(yǎng)空間，為保證培養(yǎng)空間的溫、濕、光等條件要滿足培養(yǎng)需要還需消耗很多能源。

鼓泡式生物反應(yīng)器是以氣體為分散相，液體為連續(xù)相、涉及氣液界面的反應(yīng)器，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于操作，操作成本低，混合和傳質(zhì)傳熱性能好的特點(diǎn)。利用鼓泡式生物反應(yīng)器采用液體培養(yǎng)的方式對(duì)百合脫毒籽球進(jìn)行膨大培養(yǎng)可縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高培養(yǎng)基利用率，節(jié)省培養(yǎng)空間，降低生產(chǎn)成本，可彌補(bǔ)和解決傳統(tǒng)百合脫毒籽球膨大組培方式的不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服傳統(tǒng)組培膨大培養(yǎng)脫毒百合籽球過(guò)程中培養(yǎng)方法的缺陷，既培養(yǎng)周期長(zhǎng)，培養(yǎng)基利用效率低，不能調(diào)整培養(yǎng)基成分，轉(zhuǎn)接需要大量人力；培養(yǎng)空間較大，能耗較高等缺陷。以花卉市場(chǎng)大眾喜愛(ài)的“西伯利亞”(Siberia)、“索幫”(Sorbonne)、“馬可波羅”(Marco?polo)、“曼妮莎”(Manissa)、“康伽德奧”(Concad′O)5個(gè)品種的組培脫毒籽球?yàn)椴牧希瑑?yōu)化了脫毒百合籽球液體膨大培養(yǎng)培養(yǎng)基成分和反應(yīng)器培養(yǎng)條件，通過(guò)生物反應(yīng)器液體培養(yǎng)快速膨大培養(yǎng)脫毒籽球，縮短了百合脫毒優(yōu)質(zhì)種球的快繁時(shí)間，在生產(chǎn)數(shù)量上較常規(guī)方法快4-5倍，且籽球的定植成活率高。本發(fā)明可縮短了培養(yǎng)周期，節(jié)省能源、人工和培養(yǎng)空間，提高了培養(yǎng)基的利用效率，降低生產(chǎn)成本，具有籽球成活率高、適于定植，易于在切花百合原種的規(guī)模化快繁生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種適用于鼓泡式生物反應(yīng)器的快速膨大培養(yǎng)脫毒百合籽球的優(yōu)化方法，包括液體培養(yǎng)基配方和反應(yīng)器運(yùn)行和調(diào)節(jié)的方法。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

利用生物反應(yīng)器快速膨大培養(yǎng)百合脫毒籽球的方法，按如下步驟進(jìn)行：

(1)培養(yǎng)基的配制：鱗莖膨大培養(yǎng)基(MS+NAA?0.2mg/L+CPPU?4mg/L+5％蔗糖(pH?5.8)，配制液體培養(yǎng)基體積為反應(yīng)器罐體體積的1/2-3/5。

(2)反應(yīng)器滅菌和預(yù)運(yùn)行：加入培養(yǎng)基后，對(duì)反應(yīng)器罐體和管道系統(tǒng)進(jìn)行蒸汽滅菌，滅菌后將反應(yīng)器調(diào)節(jié)到25±1℃、調(diào)節(jié)過(guò)濾空氣進(jìn)氣量，同時(shí)調(diào)節(jié)反應(yīng)器空氣出口閥使反應(yīng)器主體內(nèi)液體培養(yǎng)基處于擬均勻流動(dòng)的循環(huán)流狀態(tài)，湍動(dòng)區(qū)流速2-3cm/s，保持罐內(nèi)壓力恒定大于0.02Mpa，運(yùn)行2天，驗(yàn)證滅菌效果并確保反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定。

(3)培養(yǎng)籽球的準(zhǔn)備：在無(wú)菌環(huán)境中，將常規(guī)組培脫毒籽球芽切去葉片和部分基部組織，縱切成2-3塊直徑3.0-5.0mm籽球塊，按2500-3000籽球塊/升的數(shù)量準(zhǔn)備培養(yǎng)材料。

(4)培養(yǎng)籽球的接種：使用70％酒精對(duì)反應(yīng)器借種口進(jìn)行滅菌，點(diǎn)燃反應(yīng)器借種口的火圈對(duì)反應(yīng)器接種口滅菌用，然后在接種火圈點(diǎn)燃狀態(tài)下，迅速打開(kāi)接種口蓋將籽球轉(zhuǎn)移進(jìn)反應(yīng)器內(nèi)，然后將接種口蓋擰緊。

(5)反應(yīng)器運(yùn)行條件：將反應(yīng)器調(diào)節(jié)到22±1℃；光照強(qiáng)度1500-2000Lx，光照12h/d；調(diào)節(jié)過(guò)濾空氣進(jìn)氣量，同時(shí)調(diào)節(jié)反應(yīng)器空氣出口閥使反應(yīng)器內(nèi)液體培養(yǎng)基處于擬均勻流動(dòng)的循環(huán)流狀態(tài)，湍動(dòng)區(qū)流速3-5cm/s，保持反應(yīng)器內(nèi)壓力恒定在0.03-0.05Mpa。

(6)反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中補(bǔ)料：每2-3天觀察反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液水分損耗，用蠕動(dòng)泵通過(guò)補(bǔ)液孔向反應(yīng)器添加滅菌蒸餾水，保證培養(yǎng)液體積。觀察培養(yǎng)籽球生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)40-45d，培養(yǎng)籽球直徑可達(dá)1.0-1.4cm，根系在3-5條/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。

(7)冷藏：取出步驟(6)培養(yǎng)的組培鱗莖用清水洗去培養(yǎng)液，包裹于消毒草炭中，經(jīng)4-6℃冷藏處理45天打破休眠(4℃冷藏處理時(shí)間可在2-4個(gè)月之間)

(8)移栽馴化：將步驟(7)鱗莖，選擇具夏季冷涼氣候的800-1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲(chóng)隔離條件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒過(guò)的基質(zhì)上定植。