[發明專利]一種快速制備重組耐熱錳超氧化物歧化酶的方法

無效

• 申請號: 201010504469.0
• 申請日: 2010-10-13
• 公開（公告）號: CN101985614A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 曲劍波;朱虎;劉建國;呂建仁
• 申請（專利權）人: 中國石油大學(華東)
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物分離工程與技術領域，具體是應用超大孔金屬螯合層析介質快速分離純化在大腸桿菌中表達的重組耐高溫錳超氧化物歧化酶(SOD)的方法，產品純度達85％以上。?

背景技術

SOD是體內一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機體的氧自由基，從而避免當體內超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應，同時SOD是一種很有用途的藥用酶。醫學界已經證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用(Bioehem?J，1991，274：153-158)。目前SOD酶已作為一種保健醫藥產品廣泛應用于醫藥、食品、飲料、化妝品等行業，具有非常廣闊的市場。?

熱變性是導致酶失活的常見原因，在實際應用中，SOD的熱穩定性是決定其能否商業化的一個主要因素。從極端耐熱微生物中克隆SOD基因，然后在大腸桿菌中重組表達，從而制備耐高溫SOD成為一個研究熱點(Extremophiles，2005，9：1-6；J?Mol?Biol，270：259-274；JBiochem，1999，126：218-225)。在本發明中我們從嗜熱棲熱菌Thermus?thermophilus?HB27中克隆SOD基因，構建重組載體，在大腸桿菌中表達耐高溫Mn-SOD。?

目前，從基因工程菌中分離SOD的方法主要有：多級離心分離、雙水相萃取、超濾、層析等。然而，多級離心分離、雙水相萃取、超濾分離的SOD純度不高，通常只能得到粗酶制品，作為醫藥級產品達不到應用標準。層析法雖然能夠得到高純度的SOD，但是現有的生物大分子層析介質均屬于軟基質(瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等)，孔徑小，分離速度慢，很難進行工業放大。?

美國生物系統公司上世紀90年代開發了一種超大孔聚苯乙烯樹脂(J?Chromatog，1990，519：1-29)，粒徑8-10μm，平均孔徑有100nm和400nm兩種，被用于反相色譜和離子交換色譜對生物大分子進行快速、高分離度的制備分離。這種超大孔介質機械強度高，傳質速度快，有效降低了“停滯流動相的傳質阻力”，分離速度比常規介質快10-100倍。但由于微球制備方法復雜，重復性差，近年來少有POROS介質的應用報道。Gustavsson等人依據這一原理(J.Chromatogr.A，1999，830(2)：275-284)，將瓊脂糖制成同時具有特大孔和擴散孔的色譜介質，用于生物大分子的分離，分離時間比常規瓊脂糖珠體分別快5和3倍。但是由于瓊脂糖微球自身屬于多糖類軟凝膠，機械強度是該微球應用的一個限制因素。目前，在蛋白質等生物大分子分離純化領域，超大孔介質的應用報道較少，或局限于實驗室規模分離模型蛋白，應用于分離純化耐高溫SOD酶的研究還未見報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種操作簡單，易于放大的重組耐高溫SOD酶快速分離制備方法。?

本發明采取的技術路線是：?

1.以嗜熱棲熱菌(T.thermophilus?HB27)基因組DNA為模板，采用PCR技術克隆SOD基因，PCR產物經EcoR?I和Sal?I雙酶切后，連接到經同樣處理的pET28a⁽⁺⁾克隆/表達載體上，產生重組質粒p28ASOD，將重組載體p28ASOD導入大腸桿菌(E.coli)，獲得基因重組工程菌E.coli/p28ASOD。?

2.將重組大腸桿菌培養至OD600約為0.6(37℃，250rpm)，加入誘導劑IPTG至濃度為1mM；繼續培養8小時。?

3.取步驟2得到的發酵液500ml，離心15min(離心條件為4℃，離心力為1000×g)，用1M的TE?Buffer(pH?8.0)5-10ml清洗菌體，再離心15min，棄去上清液，加入1M的TE?Buffer(pH?8.0)5ml，混合均勻；用超聲波細胞粉碎機對其進行菌體破碎(超聲條件：聲波時間2s，間隔3s，次數99次)；超聲之后離心15min，取上清液備用。?

4.利用超大孔金屬螯合介質層析柱對步驟3所得上清液進行上樣，洗脫，一步得到目標產品。?

本發明步驟4中所用的超大孔金屬螯合介質為自制，平均粒徑55μm，孔徑300-500nm，金屬螯合配基為亞氨基二乙酸(IDA)，金屬離子為Ni²⁺，金屬螯合量為40μmol/ml介質。?