[發(fā)明專利]文心蘭離體葉片誘導體胚的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010503411.4
• 申請日: 2010-10-12
• 公開（公告）號: CN101940162A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設計）人: 卓仁英;蔣晶;喬桂榮;劉明英;李海營;邱文敏;謝麗華
• 申請（專利權）人: 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所;蔣晶
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及文心蘭組織培養(yǎng)的方法，特別是一種從文心蘭離體葉片誘導體胚并最終獲得再生植株的方法，屬于生物技術和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術領域。

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背景技術

文心蘭?(Oncidium?flexuosum?Lodd)，又名舞女蘭、瘤瓣蘭，為蘭科?(Orchidaceae)瘤瓣蘭屬?(Oncidium?Sw.)植物，是世界花卉業(yè)重要的盆花和切花種類之一。文心蘭無論屬內雜交還是屬間雜交，其親和力都較差、授粉結實機率低，通過雜交培育新品種難度大、周期長，采用新技術新方法獲得文心蘭新品種將是未來文心蘭育種的重要途徑。

能生成單細胞體胚的葉片是上佳的育種材料和轉基因受體材料。Chen?and?Chang首先報道了文心蘭（Oncidium?Gower?Ramsey）離體葉片在添加TDZ的改良1/2MS培養(yǎng)基上誘導出了直接體胚，這些體胚能形成原球莖，進而發(fā)育成正常的植株（Chen?and?Chang，Plant?Cell?Rep,?1999,?19:?143-149）。文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉背、葉緣、葉切口均能形成體胚，培養(yǎng)基的成分和植物生長調節(jié)劑以及品種差異對文心蘭離體葉片誘導體胚有很大影響（Su,?Chen?and?Chang.?Biologia?Plantarum，2006，50（1）：107-110）。建立高效穩(wěn)定的葉片體胚誘導及再生體系是開展文心蘭生物技術育種工作的關鍵步驟之一。

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發(fā)明內容

采用目前的組織培養(yǎng)體系，文心蘭離體葉片的葉尖、葉面、葉緣、葉中切口、葉基部切口均能形成體胚，這些體胚能迅速增殖并形成原球莖，與其他外植體獲得的原球莖沒有差異，最終能成為正常植株。文心蘭離體葉片誘導生成的體胚，源自葉片表皮或葉肉單一細胞，非常適合應用于育種領域，如多倍體育種、轉基因育種等。但文心蘭離體葉片體胚誘導率較低，一般不超過30%，且誘導率很不穩(wěn)定，本發(fā)明主要通過選擇適宜的葉片外植體、優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高文心蘭離體葉片體胚誘導率和穩(wěn)定性，使文心蘭離體葉片的體胚誘導率保持在90%以上，為文心蘭育種提供了大量源于葉片的胚性單細胞，這些能形成體胚-類原球莖并可獲得再生植株的胚性單細胞是轉基因育種工程的最佳受體細胞。

本發(fā)明的具體描述如下：

（1）通過組織培養(yǎng)可獲得大量的無菌文心蘭幼苗，這些幼苗起初往往是叢生的，按其形態(tài)發(fā)育特性可分為無根幼苗和帶根幼苗，盡管無根幼苗和帶根幼苗剪下的葉片都能生成體胚，但無根苗和帶根苗的生理狀態(tài)是有差異的，帶根幼苗離體葉片的體胚誘導率是無根的2-3倍，選擇帶根幼苗作為外植體供體能顯著提高文心離體葉片體胚誘導率。

（2）文心蘭無菌試管苗中的幼葉處于最初的生長階段，其葉片的長短與生長時間呈正相關，葉片的長短在一定程度上顯示了葉齡和苗齡。實驗表明葉片長度對體胚誘導率有顯著影響，小于10毫米的葉片體胚誘導率低于15%，長度為25-30毫米的葉片體胚誘導率為30%，當葉片長度大于30毫米時，葉片體胚誘導率僅為12%，當葉片長度為12-22毫米，葉片體胚誘導率超過90%。選擇適宜的葉片長度，對于維持較高的體胚誘導率至關重要，文心蘭離體葉片最適宜的尺寸是15毫米-22毫米，文心蘭無菌幼苗的長度最好在15毫米-25毫米范圍（不計根的長度）。

（3）植物生長調節(jié)劑是影響文心蘭離體葉片體胚誘導的關鍵因子之一。噻苯隆（TDZ）、6-芐基腺嘌呤和細胞激動素具有強烈促進細胞分裂的作用，三種植物生長調節(jié)劑單獨使用時，對文心蘭離體葉片體胚誘導均具有強烈的促進效果，其中TDZ的效果要好于6-芐基腺嘌呤和細胞激動素；通常三種植物生長調節(jié)劑使用的濃度范圍分別是TDZ?0.1毫克-3毫克/升，6-芐基腺嘌呤0.5毫克-3毫克/升，細胞激動素0.5毫克-3毫克/升。TDZ）、6-芐基腺嘌呤和細胞激動素的組合使用能有效促進文心蘭離體葉片體胚誘導率。較好的組合是以TDZ為主，再添加適量的6-芐基腺嘌呤或細胞激動素。比較適宜的植物生長調節(jié)劑添加方案是TDZ0.3毫克-0.5毫克/升?+?6-芐基腺嘌呤0.5毫克-1.0毫克/升。