[發明專利]一種簡便的稻曲病菌快速分離法

無效

• 申請號: 201010301356.0
• 申請日: 2010-08-04
• 公開（公告）號: CN101875906A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 楊秀娟;杜宣新;何玉仙;陳福如;甘林;阮宏椿
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種簡便、快速的微生物分離方法，尤其是一種快速分離稻曲病菌的方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

水稻稻曲病是一種世界性水稻真菌病害，為害水稻穗部，有性態為子囊菌門麥角菌屬稻麥角菌(Claviceps?oryzaesativae?Has.)，無性態為半知菌門綠核菌屬(Ustilaginoideavirens(Cooke)Takahashi)，在亞洲、非洲和美洲等許多國家和地區都有發生。稻曲病不但危害水稻，影響產量與米質，而且混雜于病稻谷中的稻曲球及病菌含有對人畜有劇毒作用的毒素，現已成為水稻生產上的重要病害。

感染稻曲病菌的穎谷，隨著白色菌絲的發育，病粒逐漸膨大，從內外穎合縫處向外伸出白色舌狀物，此白色舌狀物以較快的速度向頂端和兩側膨脹，使內外穎張開，病菌的厚垣孢子不斷產生，孢子座逐漸膨大，外膜破裂，稻曲形成。稻曲顏色初為桔黃色，以后變為暗綠色和墨綠色，最后變為黑色。北方稻曲病粒上有菌核存在，菌核表面黑色，形狀多變，但全形呈扁平狀，未成熟菌核埋在病粒內側，成熟后約5天外露易脫落。

稻曲病菌屬于一種寄生性較強腐生性較弱的真菌，稻曲球營養豐富，常伴生大量的腐生細菌和真菌及其它病原菌，加之該菌生長緩慢，培養過程中極容易污染，故分離成功率很低。

目前稻曲病分離的方法有稻曲球厚垣孢子懸液法、稻曲球組織分離法、菌核分離法及新鮮稻曲球抖落法，其中稻曲球內層組織分離法多被稻曲病研究者所采用。然而在眾多研究人員實際操作過程中，普遍發現采用稻曲球內層組織分離法雖可分離到稻曲病菌，但其培養時間較長，分離速度較慢，成功率較低，因其常伴隨其它雜菌如細菌、真菌及類似稻曲病菌的雜菌如稻黑孢霉菌(Nigrospora?oryzae)的出現，影響稻曲病菌進一步分離和純化的效果。厚垣孢子懸液法，因混于培養基中的厚垣孢子須萌發成菌絲穿過培養基，延長了厚垣孢子形成單菌落的時間，易導致生長速度過快的雜菌覆蓋于少量饅頭狀的單菌落上，加大分離純化的難度。孢子振落法，由于稻曲表面不作消毒處理，稻曲表面大量的雜菌易在培養基表面快速生長，影響厚垣孢子萌發、生長及菌落的純化。稻曲病菌菌核分離法因南方稻區少見，采用此法對研究南方稻曲病菌菌群意義不大。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡便的稻曲病菌快速分離方法，該方法在短期內可從稻曲球中大量、快速、有效地分離出稻曲病菌，為稻曲病菌的人工培養、接種技術、病菌分化變異、抗病品種篩選和遺傳機制等方面的研究奠定基礎。

本發明的目的是通過如下步驟來實現：

(1)稻曲球標樣選擇：選取從田間采集的新鮮黃色稻曲球或4℃冰箱中保存2個月內的稻曲球；

(2)單粒稻曲球消毒：在無菌水中刮洗除去稻曲球表層的雜菌5次，再用75％(重量)的乙醇溶液消毒30～60s、0.1％(重量)升汞水溶液浸泡消毒2～4min和無菌水清洗3次；

(3)稻曲球搗碎液制備：單粒稻曲球在無菌培養皿和4mL的無菌水中，用無菌手術刀搗碎消毒好的稻曲球組織后，制備含厚垣孢子和組織碎塊的稻曲球搗碎液；

(4)稻曲球搗碎液沖洗平板：用移液槍吸取1mL搗碎液沖洗分離用脅本哲氏培養基表面，隨后用移液槍吸去殘余的搗碎液；

(5)稻曲病菌分離：無菌通風條件下風干培養基表面水份后，將培養皿置于恒溫箱28℃中黑暗培養，逐日觀察分離結果；

(6)稻曲病菌純化：培養第6天后，用尖頭挑針挑取黃色或白色小菌落及白色菌絲移至培養用脅本哲氏培養基中純化培養10天；

(7)稻曲病菌保存：依據病菌在培養基的生長特性及其顯微觀察結果，將稻曲病菌移至PSA斜面培養基中培養10天后，保存于4℃冰箱中。

本步驟(4)中分離用脅本哲氏培養基配方為馬鈴薯300g、蛋白棟5g、蔗糖15g、Ca(NO₃)₂·4H₂O?0.5g、Na₂HPO₄·12H₂O?2.0g、瓊脂16g、加水定容至1000mL，在121℃下高壓濕熱滅菌20～25min，待培養基冷卻至45℃～50℃時加入抑制細菌生長的氯霉素(50μg/ml)混勻，倒入培養皿中凝固后備用。