[發明專利]具備抗血管生成活性的白蛋白變異體及其制備方法

有效

• 申請號: 201010300590.1
• 申請日: 2010-01-22
• 公開（公告）號: CN101875693A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 吳炯;白敏;易興旺
• 申請（專利權）人: 成都正能生物技術有限責任公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C12N15/14;C12N15/63;C12N1/19;A61K38/38;A61K48/00;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所 51124
• 代理人: 武森濤

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種蛋白變異體及其制備方法。

背景技術

“血管生成”(angiogenesis)一詞于1787年由英國外科醫生John?Hunter首次提出。由此，人們發現“血管生成”與胚胎發育、組織再生以及慢性炎癥有關[1]。直到1971年Folkmani證明“血管生成”與腫瘤生長有關[2]。從此，“抗血管生成”(anti-angiogenesis)成為一種新的抗腫瘤治療戰略。

血管內皮細胞的生長和分化調控是血管生成的關鍵步驟。已證明前者受酪氨酸蛋白激酶調節。血管內皮細胞生長因子(VEGF)受體-2(KDR)與VEGF結合，導致其受體酪氨酸蛋白激酶活性被活化，從而啟動一系列后續細胞信號傳導通路。這一過程對于調控內皮細胞前體分化以及原始血管網絡的形成至關重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成的關鍵點之一。[3]

臨床實驗中，許多小分子化學物質可特異性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，從而有顯著的抗血管生成效應。然而，臨床實驗結果證明這些小分子化學物質毒性副作用較大。最近，有人用中和抗體技術阻斷KDR的生物學活性，實驗證明這些抗體有有效的抗血管生成作用。進一步這些抗體已成功用于臨床腫瘤抗血管生成治療[4]。

由于噬菌體顯示技術(phage-display?technology)的廣泛應用，人們篩選到許多具有生物學活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的藥物學效應。然而，由于小肽分子在體內應用的局限性，到目前為止很少有小肽藥物的成功上市。但具有藥物效應小肽分子的發現，也為進一步藥物的設計和改造提供了非常有用的基本信息。現已發現ATWLPPR肽可以抵抗VEGF在體外刺激血管內皮細胞的增殖，并且可在動物體內完全阻斷VEGF誘導的血管生成[6]。然而，這一小分子肽在體內半衰期短，用于治療腫瘤效果有限。

人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最豐富的蛋白質之一，大約濃度為50mg/ml(600μM)，其半衰期約為19天[11，12]。白蛋白對于維持血液的PH，膠體滲透壓有著非常重要的作用，同時它也作為體內許多代謝物和脂肪酸的載體。許多藥物進入體內也利用白蛋白作為運送載體。最近，有人成功地利用白蛋白結合多肽將小肽藥物附著在白蛋白分子上，從而大大提高了小肽藥物在體內的半衰期和藥物療效作用[13]。也有人將多肽藥物分子直接與白蛋白一起表達成融合蛋白，從而利用白蛋白在體內的特性提高其多肽藥物在體內的半衰期以及生物學療效[14]。但是，直接將白蛋白進行定向化改造使之具有其他的活性還未見報道。

發明內容

本發明要解決的是現有的ATWLPPR肽體內半衰期短，用量大的問題。

解決該問題的技術方案是提供一種白蛋白變異體。該白蛋白變異體為白蛋白C末端的KEQLK肽段突變為WLPPR肽段而得。

其中，所述的白蛋白為人白蛋白。

進一步的，上述白蛋白變異體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

本發明還提供了編碼上述的白蛋白變異體的基因。

進一步的，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

同時，本發明提供了含有上述基因的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。

為了制備上述的白蛋白變異體，本發明還提供了一種制備所述白蛋白變異體的方法。該方法包括以下步驟：

a、將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成編碼氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列，得到白蛋白變異體編碼基因序列；

b、將白蛋白變異體編碼基因序列到連接到表達載體中；

c、將表達載體轉入宿主中進行表達得到白蛋白變異體。

其中，上述的表達載體優選為真核表達載體，宿主細胞優選為真核宿主細胞。

其中，上述的將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成編碼氨基酸肽段WLPPR序列的核苷酸序列的誘變方式可以使用定點誘變引物進行PCR完成定點誘變。

本發明要解決的另一個技術問題是提供上述的白蛋白變異體或表達載體在制備抗血管生成藥物中的用途。同時本發明提供了一種抗血管生成藥物，該抗血管生成藥物由上述的白蛋白變異體或表達載體添加藥學上可接受的輔助性成分制備而成。