[發(fā)明專利]基于重組UL51蛋白的膠體金免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010299530.2
• 申請日: 2010-09-30
• 公開（公告）號: CN102012432A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 程安春;汪銘書;沈嬋娟;陳孝躍
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物工程技術(shù)中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/532;C12N15/38;C12N15/70;C07K14/03
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中鴨瘟病毒抗體的檢測，特別涉及基于重組UL51蛋白的膠體金免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨瘟(Duck?plague，DP)，又稱鴨病毒性腸炎(Duck?viral?enteritis，DVE)，是鴨、鵝、天鵝等雁形目動物的一種急性接觸性傳染病，其致病特征是血管損傷、組織出血、消化道和淋巴器官損傷。該病可導(dǎo)致商品水禽的產(chǎn)蛋量下降和死亡，對野生水禽也有不同的致死率。DP的病原為DPV(Duck?plague?virus，DPV)，DPV是一種泛嗜性全身性感染的病毒，目前大多數(shù)學(xué)者把其暫時列為α皰疹病毒亞科，但尚未分屬。目前，已報道的DPV檢測方法有病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光實時定量PCR、間接免疫酶組化法、間接免疫熒光法、電鏡觀察、原位雜交、間接原位PCR法、血清中和試驗(SNT)、瓊脂凝膠擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、反向被動血凝試驗、微量固相放射免疫測定法、生物素標(biāo)記寡核苷酸探針原位檢測、地高辛標(biāo)記核酸探針法和光敏生物素標(biāo)記法等，這些方法各有特點。但是，傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法大約需4～5d，且方法繁瑣，費時費力。一些免疫學(xué)方法以及PCR方法也往往需要特殊的儀器、設(shè)備以及熟練的技術(shù)人員。此外，許多血清學(xué)檢測方法都是基于純化的DPV全病毒產(chǎn)生的抗體來檢測DPV，由于病毒純化的復(fù)雜性和純化后的病毒中會摻雜有許多宿主細(xì)胞成分，而導(dǎo)致許多假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，對蛋白功能的研究日趨增強，特別是對有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表達(dá)的重組蛋白作為包被原檢測病毒抗血清的ELISA方法和膠體金免疫層析法已被大量報道。但是，基于重組UL51蛋白的鴨瘟病毒抗體檢測方法尚未報到，重組UL51蛋白是否與抗DPV陽性血清發(fā)生強烈的免疫反應(yīng)、是否可用于鴨瘟病毒抗體的檢測尚需證實。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于重組UL51蛋白為抗原的膠體金免疫層析試紙檢測鴨瘟病毒抗體，所述重組UL51蛋白的獲得是通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-UL51、轉(zhuǎn)化并發(fā)酵培養(yǎng)，收集到了大量的含有重組UL51蛋白的菌體沉淀；為保證包被蛋白成分單一，降低非特異性結(jié)合，接著對重組UL51蛋白進行了純化；且將純化的蛋白再依次分步梯度透析，以降低尿素濃度使該蛋白恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)，復(fù)性后的蛋白具有較好的抗原性；同時，用Western?blotting分析證實該蛋白可與抗DPV陽性血清發(fā)生強烈的免疫反應(yīng)；進一步確定重組UL51蛋白標(biāo)記濃度、兔免疫球蛋白的包被濃度及金標(biāo)墊的包被參數(shù)后，制備了膠體金免疫層析試紙，該試紙檢測鴨瘟病毒抗體的特異性、靈敏性較高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

基于重組UL51蛋白的膠體金免疫層析試紙，由底板、硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸收墊組成，硝基纖維膜上有測試線和對照線，所述硝基纖維膜上的測試線由濃度大于或等于2mg/mL的重組UL51蛋白包被而成，對照線由濃度大于或等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成；所述金標(biāo)墊由膠體金標(biāo)記的濃度大于或等于2mg/mL的重組UL51蛋白和膠體金標(biāo)記的濃度大于或等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白組成的混合液包被而成。

進一步，所述的基于重組UL51蛋白的膠體金免疫層析試紙，所述硝基纖維膜上的測試線由濃度等于2mg/mL的重組UL51蛋白包被而成，對照線由濃度等于1mg/mL的兔免疫球蛋白包被而成，所述金標(biāo)墊由膠體金標(biāo)記的濃度等于2mg/mL的重組UL51蛋白和膠體金標(biāo)記的濃度等于2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白組成的混合液包被而成。

本發(fā)明的目的之二在于提供所述膠體金免疫層析試紙的制備方法，該方法簡單實用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

所述膠體金免疫層析試紙的制備步驟具體步驟為：

a硝基纖維膜上測試線和對照線的噴制：將濃度≥2mg/mL的重組UL51蛋白噴點于硝基纖維膜上形成測試線，將濃度≥1mg/mL的兔免疫球蛋白噴點于硝基纖維膜上形成對照線，干燥后低溫密封保存?zhèn)溆茫?/p>

b金標(biāo)墊的制備：將玻璃纖維素膜浸于由膠體金標(biāo)記的濃度≥2mg/mL的重組UL51蛋白和膠體金標(biāo)記的濃度≥2mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白組成的混合液中，再將該膜浸于玻璃纖維素膜處理液中封閉非特異性結(jié)合位點，干燥后得金標(biāo)墊；

c膠體金免疫層析試紙條的組裝：分別將硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo)墊、吸收墊依次粘在所述底板上，硝基纖維膜上所述所述對照線靠近吸收墊端，所述測試線靠近樣品墊端，再切割成一定寬度的試紙條，密封包裝，干燥低溫保存；