[發明專利]一種構建雜交測序文庫的方法

有效

• 申請號: 201010299269.6
• 申請日: 2010-09-21
• 公開（公告）號: CN102409047A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 蔣慧;劉曉;吳仁花;歐陽偉漢;武靖華;吳明枝;趙美茹
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B40/08;C40B50/06
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明涉及核酸測序技術領域，特別是序列捕獲技術領域，特別是基于雜交的序列捕獲技術。另外，本發明還涉及標簽技術，以及實現多個樣品在同一反應體系中進行序列捕獲的方法。本發明的方法特別適用于第二代測序技術，尤其是solexa測序技術。本發明的方法可用于基因組學研究。

背景技術

以Illumina?solexa、AB?Solid和Roche?454為代表的第二代測序技術使測序成本大大降低，在近幾年得到快速發展，并成為基因組學研究的重要工具。與鏈終止法的sanger測序技術相比，第二代測序技術采用邊合成邊測序的技術策略。第二代測序技術最大的特點是高通量，其可對數以億計的DNA片段同時進行測序，目前一臺高通量測序儀一次可產生高達200Gb的數據，相當于將一個人的全基因組測序65次。然而這種高通量的測序技術是通過超聲波或其他方法將基因組打斷成一系列的小片段，并在小片段的兩側加上接頭，然后通過接頭引物進行橋式PCR或emotion?PCR擴增形成測序的基本單位，再根據接頭上的部分序列設計公共測序引物，對基因組DNA進行測序。

盡管高通量的測序技術使測序成本大大降低，然而測序一個人的全基因組序列仍需要數萬美元，這對于需要對大量樣品進行測序的疾病研究等研究項目來說，總測序成本仍然很昂貴，難以大規模推廣應用。另一方面，對于研究人類某些疾病的科學家來說，他們并不需要對全基因組進行測序，他們感興趣的往往只是很小部分的基因組區域，例如全外顯子區(相當于1％的人全基因組大小)，如果能選擇性地對這些區域進行測序，將使測序總成本顯著降低同時也能縮短測序時間。序列捕獲技術是一種對基因組特定區域進行選擇性富集的技術，其通過合適的方法將感興趣的區域從基因組中分離出來，然后再對該目標區域進行測序，這對于低成本地有針對性的進行基因組學研究有非常重要的意義。

目前常用的序列捕獲方法主要有三種：PCR法、分子倒置探針法(Molecular?insersion?probes，MIP)和雜交法。PCR法具有高靈敏性、高特異性和重復性好等優點。PCR富集法在第二代測序技術平臺也有潛在的應用前景，其適合用于捕獲一些很小的區域，特別是一些連續的區域。對于較大的非連續的區域，如全外顯子，該方法需要合成大量的引物、大規模的PCR反應和高強度的勞動力等。因此，PCR序列捕獲方法的適用性受到較大的限制。盡管最近報道的微滴PCR(RainStorm)等PCR技術能在一定程度上緩解上述部分問題，然而實際上這些PCR反應由于在同一反應中使用多種引物，導致大量非特異擴增產物的產生，并且容易出現部分區域無法擴增的情況，此外其擴增的區域大小也有限。

分子倒置探針富集法具有樣品前期處理簡單、樣品需求量極小等優點，然而其需要合成價格較高的分子探針、均一性較差、難以對一些區域較大的基因組序列進行捕獲等缺點，限制了該技術在第二代測序平臺的應用前景。

基于雜交的序列捕獲技術是目前在第二代測序平臺中使用較多的序列富集方法，主要分為芯片雜交和液相雜交兩種。芯片雜交序列捕獲技術是一種將探針合成在芯片上，并在芯片上進行雜交的高通量序列捕獲技術，其可以在一個芯片內捕獲整個外顯子甚至更大的區域。液相雜交技術是通過將芯片上合成的探針剪切回收之后進行擴增富集而構建用于雜交的目的雜交探針庫，液相雜交在動力學上相對固相雜交更具優勢，能降低對于樣品起始量要求。

芯片雜交技術與液相雜交技術屬于高通量的序列捕獲技術，對于需要對大量樣品進行重測序的項目來說，逐一對樣品進行雜交與洗脫需要大量的勞動力與時間，同時也增加了成本和操作錯誤的風險。為了與第二代測序技術平臺聯合使用，我們需要實現多個樣品在同一反應體系中進行雜交洗脫，同時在測序后又能分辨來源不同的樣品，這將使工作量與工作時間大大減少，對減少操作錯誤的風險也有一定的預防作用。

最近，國外研究人員報道了多個樣品混合雜交的方法(專利號：WO2009106308；公開號：WO2009/106208A2；公開日：2009年9月3日)，該方法通過連接接頭的方法引入代表特定樣品的標簽序列(共133個標簽序列)來區分不同來源的DNA樣品。所有標簽序列均由11個脫氨核苷酸組成，位于測序引物和DNA樣品之間。在構建測序文庫時，每個樣品接上包括不同標簽序列的接頭，混合后在NimbleGen芯片雜交系統中進行序列捕獲。洗脫后的捕獲序列在Roche?454測序平臺進行測序，通過測序接頭上的標簽序列來區分不同來源的樣品。

然而，該技術在應用范圍和效率等多個方面還存在缺陷：