[發(fā)明專利]小分子RNA標(biāo)簽

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010299265.8
• 申請(qǐng)日: 2010-09-21
• 公開（公告）號(hào): CN102409046A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章文蔚;周妍;張艷艷;徐小紅;張秀清;楊煥明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 程泳

1.一組標(biāo)簽，其中所述一組標(biāo)簽包括如下或由如下組成：表1所示16個(gè)標(biāo)簽或與之相差1個(gè)堿基的標(biāo)簽中的至少2個(gè)，或至少3個(gè)，或至少4個(gè)，或至少5個(gè)，至少6個(gè)，或至少7個(gè)，或至少8個(gè)，或至少9個(gè)，或10個(gè)，或至少11個(gè)，或至少12個(gè)，或至少13個(gè)，或至少14個(gè)，或至少15個(gè)，或全部16個(gè)，

所述一組標(biāo)簽優(yōu)選地至少包括表1所示的16個(gè)標(biāo)簽中的Index1和Index2，或Index3和Index4，或Index5和Index6，或Index7和Index8，或Index9和Index10，或Index11和Index12，或Index13和Index14，或Index15和Index16，或者他們?nèi)魏蝺蓚€(gè)或多個(gè)的組合。

2.權(quán)利要求1所述的標(biāo)簽，其中所述相差1個(gè)堿基包括標(biāo)簽中1個(gè)堿基的取代、添加和刪除。

3.權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)簽用于小分子RNA文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序的用途，其中所述標(biāo)簽包含在用于擴(kuò)增目的序列的PCR引物中，從而構(gòu)成各自相對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽PCR引物。

4.權(quán)利要求3所述的用途，其中所述標(biāo)簽嵌入用于擴(kuò)增目的序列的PCR引物中，或者通過(guò)或不通過(guò)連接子與用于擴(kuò)增目的序列的PCR引物的5’端或3’端相連，優(yōu)選地是不通過(guò)連接子與用于擴(kuò)增目的序列的PCR引物的5’端相連，從而構(gòu)成各自相對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽PCR引物。

5.使用權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)簽構(gòu)建的小分子RNA文庫(kù)。

6.權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)簽所對(duì)應(yīng)的一組標(biāo)簽PCR引物，其包含權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)簽，所述一組標(biāo)簽PCR引物包括如下或由如下組成：表2所示16個(gè)標(biāo)簽PCR引物或與其中包含的標(biāo)簽序列相差1個(gè)堿基的標(biāo)簽PCR引物中的至少2個(gè)，或至少3個(gè)，或至少4個(gè)，或至少5個(gè)，至少6個(gè)，或至少7個(gè)，或至少8個(gè)，或至少9個(gè)，或10個(gè)，或至少11個(gè)，或至少12個(gè)，或至少13個(gè)，或至少14個(gè)，或至少15個(gè)，或全部16個(gè)，

所述一組標(biāo)簽PCR引物優(yōu)選地至少包括表2所示的16個(gè)標(biāo)簽中的Index1_PCR_2.0和Index2_PCR_2.0，或Index3_PCR_2.0和Index4_PCR_2.0，或Index5_PCR_2.0和Index6_PCR_2.0，或Index7_PCR_2.0和Index8_PCR_2.0，或Index9_PCR_2.0和Index10_PCR_2.0，或Index11_PCR_2.0和Index12_PCR_2.0，或Index13_PCR_2.0和Index14_PCR_2.0，或Index15_PCR_2.0和Index16_PCR_2.0或者他們?nèi)魏蝺蓚€(gè)或多個(gè)的組合。

7.權(quán)利要求6所述的標(biāo)簽PCR引物，其中所述相差1個(gè)堿基包括標(biāo)簽中1個(gè)堿基的取代、添加和刪除。

8.使用權(quán)利要求6或7所述的標(biāo)簽PCR引物構(gòu)建的小分子RNA文庫(kù)。

9.權(quán)利要求6或7所述的標(biāo)簽PCR引物用于小分子RNA文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序的用途。

10.一種用于小分子RNA文庫(kù)的構(gòu)建并測(cè)序方法，其包括：

1)提供n個(gè)總RNA樣品并回收18～30nt的小RNA，n為整數(shù)，且1≤n≤16，優(yōu)選地2≤n≤16，所述樣品包括但不限于來(lái)自植物如水稻、擬南芥和動(dòng)物如小鼠、人，所述的回收可以通過(guò)例如電泳，特別是變性PAGE電泳；

2)添加接頭：在適合于連接接頭的條件下，將分離的小分子RNA分別與5’接頭、3’接頭連接，連接順序可以是先5’接頭后3’接頭，也可以是先3’接頭后5’接頭；

3)構(gòu)建文庫(kù)：隨后將帶有接頭的目的片段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增帶有接頭的目的片段，其中對(duì)于每一個(gè)樣品，使用一個(gè)標(biāo)簽PCR引物，所述標(biāo)簽PCR引物是含有如權(quán)利要求1所述的標(biāo)簽的標(biāo)簽PCR引物，特別是如權(quán)利要求3中所述的標(biāo)簽PCR引物，最后切膠回收帶有接頭的目的片段，所述片段優(yōu)選的是約100bp；

4)混合：當(dāng)n＞1時(shí)，將各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起；當(dāng)n＝1時(shí)，直接進(jìn)行步驟5)；

5)測(cè)序：將各樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物利用測(cè)序技術(shù)，優(yōu)選地是Solexa測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，其中需要小分子RNA測(cè)序引物和小分子RNA標(biāo)簽測(cè)序引物分別對(duì)目的片段和標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序。