[發明專利]基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法

無效

• 申請號: 201010299121.2
• 申請日: 2010-10-02
• 公開（公告）號: CN101948926A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 楊立桃;張大兵;郭金超
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步：多重模板的合成：將含有不同目標DNA分子的純化DNA模板通過一個或幾個常規復合PCR應用目標特異性引物進行預擴增，產生含有通用序列尾巴的多重模板；

第二步：通用微滴PCR擴增：在通用微滴PCR中，使用一對與通用序列尾巴互補的通用引物在水油乳化劑中對純化的復合PCR預擴產物進行微滴PCR擴增；

第三步：毛細管凝膠電泳分析：根據目標序列的大小不同，應用毛細管凝膠電泳對純化的微滴PCR擴增產物進行自動分離檢測。

2.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的純化DNA模板是指應用DNA提取試劑盒，從原材料中分離純化的獲得的用于PCR擴增的基因組DNA。

3.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的目標特異性引物是指長度為43±6Nt的寡核苷酸鏈，由5’端的通用序列尾巴和3’端目標特異性互補序列組成，其3’端的目標特異性序列部分與目標基因序列完全互補或者相同，5’端的通用尾巴序列部分與通用引物序列相同。

4.根據權利要求3所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的通用引物是指長度為20Nt的寡核苷酸鏈，正、反向通用引物分別與目標特異性引物的的5’端相同。

5.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的多重模板是指，通過復合PCR預擴增所產生的不同PCR產物的混合模板，其產物的兩端分別含有一段來自目標特異性引物的通用序列尾巴。

6.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的微滴是指，25攝氏度條件下，取1體積份的PCR反應混合液在1.5分鐘內逐滴加入到2體積份的油-表面活性劑混合物中，同時利用渦旋混合器進行混勻得到水油乳化劑，該水油乳化劑中微滴的直徑在1～8μM，每微升的水油乳化劑中包含3×10⁶到1×10⁷個微滴。

7.根據權利要求1或6所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的水油乳化劑的組分及其含量為：1體積份的水相和2體積份的油相，其中的水相的組分為：1×KOD-Plus-反應緩沖液、10g/L?BSA、1.5mM?MgSO₄、200μM?dNTP、400nM引物Uni-F/R、5.2U?KOD-Plus-DNA聚合酶、以及適量模板DNA分子；油相組分為：Span804.5％(v/v)、Tween?80?0.4％(v/v)、Triton?X-100?0.05％(v/v)、礦物油95.05％(v/v)。

8.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的PCR產物純化是指應用PCR產物純化試劑盒純化復合PCR預擴增產物。

9.根據權利要求1所述的基于毛細管凝膠電泳檢測的微滴聚合酶鏈式反應分析方法，其特征是，所述的純化是指微滴PCR完成后，收集相同反應的水油乳化劑16000g，并在室溫環境下離心處理5分鐘后取下層包含微滴PCR擴增產物的水相，并用PCR產物純化試劑盒純化該水相。