[發(fā)明專利]雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010298850.6
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN102037896A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 施季森;李婷婷;陳金慧;龍偉
• 申請（專利權）人: 南京林業(yè)大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發(fā)明涉及林業(yè)中的種苗繁殖生物技術領域，具體涉及一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法。

背景技術

木蘭科鵝掌楸屬(Liriodendron)樹種在自然界僅存兩個種，即北美鵝掌楸(L.tulipifera?Linn.)和鵝掌楸(L.chinense(Hemse.)Sarg)，現存資源十分稀少，是我國二級珍惜瀕危保護樹種。鵝掌楸具有生長迅速，干形直，木材用途廣，葉和花觀賞價值高等特點，特別是南京林業(yè)大學葉培忠教授等人利用中國馬褂木與北美鵝掌楸雜交試驗成功獲得雜交鵝掌楸(Liriodendron?chinense×L.tulipifera)，具有明顯的雜種優(yōu)勢，其生長速度快，抗性強，樹姿優(yōu)美，花色美麗，葉形獨特，病蟲害少，材質紋理細膩，易加工，是集荒山造林、工業(yè)用材、園林觀賞、綠化等多種用途于一身的優(yōu)良樹種，市場前景廣闊。

目前雜交鵝掌楸主要通過人工雜交的有性繁殖及扦插、嫁接等傳統(tǒng)方法進行繁殖。但雜交制種效率低、種子量少，F1代的種子發(fā)芽率很低，同時由于扦插生根難(季孔庶，2005)，而嫁接繁殖系數又低，很大程度上限制了優(yōu)良雜種的快速繁殖和利用，因此以傳統(tǒng)的繁殖方式育苗，速度緩慢，優(yōu)良種苗數量遠遠供不應求。有學者報導過雜交鵝掌楸植物組織培養(yǎng)途徑進行快速繁殖的一些研究(劉根林，2000；陳金慧等，2002；蔣澤平等，2004；蔡桁等，2005；田敏等，2006)，但均未見生產性應用。相對于傳統(tǒng)的育苗方式，體細胞胚胎發(fā)生具有數量多、速度快、結構完整、再生率高等優(yōu)點。陳金慧等于2003年利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交鵝掌楸未成熟胚，成功誘導了雜交鵝掌楸體細胞胚胎發(fā)生，使雜交鵝掌楸的快速繁育體系取得了重大進展，并成功進入工廠化生產育苗，在很大程度上緩解了市場供需矛盾，但雜交鵝掌楸種苗的供應仍然不能滿足市場的需求。

植株再生無疑為解決這種供需矛盾提供了一種有效方案，并且一個成熟的體胚發(fā)生懸浮體系對進行植物體細胞雜交、遺傳轉化、植物種質資源的超低溫保存以及對植物體胚發(fā)育等方面的研究提供了極大的便利。同時，懸浮培養(yǎng)中同步化的實現，是利用生物反應器建立規(guī)模化培養(yǎng)體系的基礎，同時也是研究體胚發(fā)生分子機理的理想平臺，因此實現懸浮培養(yǎng)中體胚發(fā)生的同步化控制顯得尤為重要。

培養(yǎng)同步分裂的細胞群，可以在人工的控制下獲得具有同樣代謝活性和功能的細胞所組成的大群體，為獲得同步形態(tài)發(fā)生的胚狀體奠定基礎。體胚的同步化是指促使所有培養(yǎng)的細胞或發(fā)育中的細胞團塊進入同一個分裂時期，只有同步化了細胞才可能成批地產出成熟胚胎。因此控制體胚的同步發(fā)生要從控制細胞的同步分裂開始，目前控制細胞同步分裂的常用方法主要是化學誘導和物理選擇。大多時候單一的同步化控制方法并不能取得最佳效果，這就需要將兩種或多種方法綜合應用。根據所選外植體的生物性狀及生理生化特點采用不同的方法組合或試劑組合達到最佳的同步誘導效果。

關于鵝掌楸屬體胚發(fā)生的懸浮培養(yǎng)體系，僅有Scott?Merkle等(1991)報道過北美鵝掌楸的體胚發(fā)生，但未見大規(guī)模生產的報道。目前，通過對雜交鵝掌楸的胚胎發(fā)生過程進行的掃描電鏡觀察以及對這一過程中ATP酶活性進行的超微細胞化學定位，對于非胚性細胞向胚性細胞的轉化，胚性細胞的進一步發(fā)育分化，以及體細胞胚胎發(fā)生中胚性細胞的起源及發(fā)育已有了初步的了解，同時對體胚系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性的分析表明，雜交鵝掌楸體細胞胚胎再生體系具有長時間保持旺盛的體胚發(fā)生能力(陳金慧等，2006)。陳志等(2007)也通過對影響懸浮培養(yǎng)的一些物理因素如搖床轉速、細胞起始密度，繼代周期，懸浮物的選擇等的研究初步建立了雜交鵝掌楸胚性愈傷懸浮培養(yǎng)體系，但高頻、同步的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)體系的建立還未見報道。

發(fā)明內容

發(fā)明目的：針對現有技術中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，為滿足雜交鵝掌楸的大規(guī)模生產提供有效的方法。

技術方案：為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

本發(fā)明的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，以懸浮培養(yǎng)條件下的胚性細胞為起始材料，在液體培養(yǎng)基上進行擴大培養(yǎng)并使細胞分散，采用物理過篩和密度梯度離心結合的方法使植物細胞群大小均一，同時調節(jié)激素的種類和用量誘導植物細胞胚性，調整液體培養(yǎng)物密度分級轉接到含有適量ABA的培養(yǎng)基上，加大滲透壓，促使體胚高頻同步發(fā)生，最后獲得生長狀態(tài)正常一致的再生植株。具體實施包括以下步驟：

(1)雜交鵝掌楸愈傷細胞懸浮系擴大培養(yǎng)