[發明專利]一種腺病毒-甲病毒雜合病毒的制備及其應用

無效

• 申請號: 201010298821.X
• 申請日: 2010-10-08
• 公開（公告）號: CN102002484A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發明（設計）人: 王立生;楊月峰;魯茁壯;李澤良;王華;肖鳳君;吳祖澤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/02
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技術領域

本發明涉及生物技術和基因治療領域，具體為一種具有造血靶向、且目的基因高效表達的腺病毒-甲病毒雜合載體的構建、病毒拯救及其在造血靶向基因修飾和藥物開發中的應用。

背景技術

基因治療已經成為遺傳性疾病和部分獲得性疾病的主要治療手段，基因治療藥物也逐步成為生物藥物的重要組成部分。而限制基因治療藥物發展的瓶頸是基因治療載體缺乏靶向性以及載體整合的隨機性。目前，用于基因轉移的載體很多，其中腺病毒載體(Adenovector，Ad)以其宿主范圍廣、感染效率高、理化性質穩定、易制備高滴度病毒、不整合入宿主基因組、遺傳毒性較低、能感染分裂期和非分裂期細胞等優點被廣泛用于腫瘤的基因治療。但是，常用的5型腺病毒(Ad5)載體對造血細胞感染效率很低，限制了其在造血系統或造血相關基因治療中的應用，如白血病基因修飾瘤苗的制備、造血干細胞的基因修飾等。

(一)造血靶向腺病毒載體

Ad5主要是通過其五鄰體的纖維頂球識別細胞表面的柯薩奇-腺病毒受體(Coxsackie?virus?and?Adenovirus?Receptor，CAR)進入細胞的，而造血細胞表面CAR表達水平很低；而人B組11p型腺病毒(Ad11p)可通過CD46受體分子進入細胞，且造血細胞表面CD46豐度很高。本實驗室先前的研究，將5型腺病毒載體的纖維頂球部分替換為Ad11p的纖維頂球，從而改變了它的靶向性，能明顯增強了對造血細胞的感染效率。以綠色熒光蛋白(Green?Fluorescent?Protein，GFP)為報告基因，檢測了改造后的嵌合體腺病毒Ad5/F11p對CD34⁺細胞和原代白血病細胞的感染效率，在200MOI感染強度下，其對臍帶或骨髓來源的CD34+細胞的感染效率為40％左右，明顯高于Ad-GFP；而其對髓系白血病細胞的感染率10.58％～92.63％，中位數30％，是Ad5的10倍；但對淋巴系白血病的感染效率仍低于10％。

雖然Ad5/F11p對CD34⁺細胞和原代白血病細胞的感染率有了很大提高，但對于基因修飾來說還不是很理想，特別是淋巴系白血病細胞。但本實驗室的研究表明，在淋巴系白血病細胞，CD46的表達很高，甚至比髓系白血病細胞的中還高。提示Ad5/F11p對淋巴系白血病感染效率低，可能不是病毒進入細胞困難引起的，而是報告基因表達效率低造成的。因此，簡單地用報告基因表達效率表示病毒感染效率是不恰當的。

在造血細胞的基因修飾中，不但需要載體的高感染效率，也需要目的基因的高表達效率。因此，以Ad5/F11p為基礎，引入目的基因高表達機制對于造血靶向基因治療載體的研究具有重要意義。

(二)甲病毒載體

近年來的研究表明，基于甲病毒(alphavirus)的病毒載體或復制子(replicon)能在哺乳動物細胞高效介導外源基因的表達，并在疫苗制備中得到廣泛應用。甲病毒為披膜病毒科成員，基因組由12kb的單股正鏈RNA分子組成。當病毒感染脊椎動物細胞時，進入細胞漿的基因組RNA，可將5’端約2/3序列的開放讀碼框(Open?Reading?Frame，ORF)翻譯并裂解加工成RNA復制和轉錄所需的4種非結構蛋白(non-structure?protein，nsP1～4)，即復制酶。復制酶識別正鏈RNA?3’端，合成全長的負鏈RNA，作為新的基因組RNA復制和亞基因組RNA轉錄的模板。亞基因組mRNA是從負鏈RNA內部的一個位點開始轉錄而成的，其中的ORF翻譯產生結構蛋白(衣殼蛋白，包膜糖蛋白等)，而這些結構蛋白可包裝病毒基因組形成新的病毒顆粒。

基于RNA的甲病毒復制子載體，只需將甲病毒基因組的結構蛋白部分替換為目的基因即可，但此類載體需在體外轉錄制備成加帽的RNA，且要求在特殊條件下處理RNA并轉染細胞，嚴重限制了其應用。而基于DNA/RNA的甲病毒復制子載體，在甲病毒基因組5’端加入一個RNA聚合酶II的啟動子(如CMV等)，以DNA的形式轉染進入細胞，運輸到細胞核后，由RNA聚合酶II轉錄為RNA，再運輸到細胞漿并表達非結構蛋白，從而啟動亞基因組mRNA的合成，使亞基因組中的目的基因得以大量表達。

甲病毒載體的最大特點在于亞基因組能夠在細胞漿大量合成，因此，目的基因表達效率高。但甲病毒對造血細胞的感染效率低，限制了它在造血細胞基因修飾中的應用，目前基本未見甲病毒載體用于造血細胞的研究報道。