[發明專利]一種制備誘導多潛能干細胞的方法,試劑盒及用途

有效

• 申請號: 201010296987.8
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN102260646A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 鄧宏魁;趙揚;時艷;張薔;李艷琴;尹曉磊
• 申請（專利權）人: 北京瑞普晨創科技有限公司;北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/078;C12N5/074
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明涉及一種制備誘導多潛能干細胞的方法，試劑盒及用途。?

背景技術

(一)干細胞多能性(pluripotency)的特點：?

胚胎干細胞因為具有向三個胚層細胞的分化能力而被稱為“多潛能”干細胞，此外，胚胎瘤(EC)細胞和胚胎生殖(EG)細胞均具有和胚胎干細胞類似的多能性。多潛能干細胞共同的特點是：細胞核質比比較大，克隆樣生長(人胚胎干細胞較扁平，而小鼠胚胎干細胞較為隆起，細胞界限不明顯)，具有AP酶活性，特異地表達SSEA4，TRA1-60，TRA1-81等表面標志(小鼠胚胎干細胞還特異性地表達SSEA1，而人胚胎干細胞不表達SSEA1)，及Oct4，Nanog，Sox2，rex1(ZFP42)，GDF3，lin28，TDGF1等標志性基因。此外，還可以在懸浮培養條件下，形成胚胎小體(Embryonid?bodies)結構，并發生自發分化，EB形成6-9天后貼壁培養，可檢測到向內、中、外三個胚層分化的細胞。?

(二)誘導多能性干細胞(IPS細胞)的研究?

2006年8月，日本京都大學再生醫科學研究所教授山中伸彌(Yamanaka)實驗室首先宣布在小鼠的成纖維細胞中導入4個基因(Oct4，Sox2，c-Myc和KLF4)成功地將其誘導成為全能性的干細胞，其性質和胚胎干細胞類似，(Takahashi?and?Yamanaka，2006)從而首次揭示了通過轉基因可以在分化的細胞中建立全能性。這是對許多年來的生物學觀念的一次巨大的沖擊，并且有望使基于干細胞技術的治療性克隆徹底擺脫卵子來源的困境和破壞胚胎引起的倫理爭議。目前使用這種人工干細胞米進行細胞治療患者尚存在安全隱患，但它不久后可能被應用于疾病模型的制作和新藥研發等研究工作。這一成果加快了再生醫學的研究步伐，具有劃時代的意義。?

在該實驗中，Yamanaka等人首先選取了和小鼠胚胎干細胞自我更新及維持多能性相關的24個基因，分別將他們克隆到逆轉錄病毒載體，對胚胎成纖維細胞進行共轉染，在進行基于Fbx15報告體系的篩選之后，他們觀察到了ES-like的細胞集落的形成。?

經過對這24個基因的進一步分析，他們發現，僅轉導Oct4，Sox2，c-Myc，KLF4就可以使胚胎成纖維細胞完全轉變成為誘導的多潛能干細胞(iPS細胞-Induced?Pluripotent?Stem?Cells，俗稱“誘導的多潛能干細胞”)。該IPS細胞擁有正常的核型，表達類似胚胎干細胞的分子標志，可以在體外被誘導分化為內、中、外三個胚層的終末分化的細胞，能夠在裸鼠體內形成畸胎瘤，在畸胎瘤中含有內、中、外三個胚層的分化細胞。此外，和胚胎干細胞一樣，IPS細胞在Nanog和Oct4promoter上檢測到H3的低甲基化和高乙酰化。然而，采用Fbx15基因作為reporter篩選出來的細胞并不具有完整的全能性，如：內源Oct4等干性基因仍然沒有能夠正常地啟動表達，不能通過囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。?

此后，2007年5月份，Yamanaka實驗室和Jaenisch實驗室同時在Nature雜志上發表文章聲明(Okita?et?al.，2007；Wernig?et?al.，2007)，他們采用新的報告基因(基于Oct4或nanog的promoter)進行抗藥性篩選可以產生完全重編程的IPS細胞，新的IPS細胞可以使內源基因重新啟動，并且可以通過囊胚注射制備成為嵌合小鼠，并整合到生殖系統中，產生完全由該IPS細胞生成的后代小鼠。Jaenisch實驗室的實驗結果表明，該IPS細胞甚至通過四倍體胚胎嵌合技術制備發育正常的小鼠胚胎。此外，新的IPS細胞的Oct4啟動子及Nanog啟動子的甲基化修飾也幾乎被完全擦除。?

同時，Hochedlinger實驗室和Plath實驗室合作在Cell?stem?cells上發表文章，用更加豐富的手段驗證了IPS細胞完全重編程的效果。(Maherali?et?al.，2007)例如，同分化細胞融合使分化細胞去分化的能力，雌性細胞的X染色體失活現象，H3K4和H3K27的甲基化譜等等。由此，4個因子誘導分化細胞成為全能性干細胞的事實被完全確認！?