[發明專利]一種二苯甲酮的酶聯免疫檢測方法

無效

• 申請號: 201010295977.2
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN101949924A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 胥傳來;林菲;許宙;陳蓮君;宋姍姍;劉麗強;王利兵
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N21/31;G01N33/531
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種二苯甲酮的酶聯免疫檢測方法，其特征在于利用合成的4-氨基二苯甲酮與BSA偶聯物免疫原免疫得到多克隆抗體，以4-氨基二苯甲酮半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以二苯甲酮為標準品，建立了包裝材料紙中二苯甲酮的間接競爭酶聯免疫檢測方法；步驟如下：

（1）以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原1:1000~1:64000，加入酶標板中，每孔加入100μL，4℃孵育過夜，按照常規ELISA方法封閉洗滌；

（2）用PBST將二苯甲酮標準品稀釋成0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列濃度，將系列濃度之一的二苯甲酮標準品或待測樣品加入酶標板中，每孔加50μL；同時加入以抗體稀釋液稀釋1:1000~1:4000的多克隆抗體，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌3~5次；

（3）以抗體稀釋液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP稀釋為1:3000，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌3~5次；

（4）配置顯色液

A液：0.933?g檸檬酸，3.68?g?Na₂HPO₄·12H₂O，18?μL30%H₂O₂用超純水定容至100?mL；

B液：60?mg?3,3^/,5,5^/-四甲基聯苯胺TMB溶于100?mL乙二醇中；

使用前將A液與B液以5:1體積混合；

（5）每孔加入顯色液100μL，37℃顯色15min；每孔加入終止液2M?硫酸溶液100μL；酶標儀450nm測吸光值OD。

2.?根據權利要求1所述的二苯甲酮的酶聯免疫檢測方法，其特征在于包裝材料紙中待測樣品的提取方法為：

(1)?取陰性樣本-白紙為代表性樣品，將其剪碎至5mm×5mm大小，混勻，分別稱取1.0g試樣置于100mL具塞錐形瓶中，然后將一定濃度的二苯甲酮標準品的甲醇溶液加入其中，使二苯甲酮在紙試樣體系中的終濃度分別為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，室溫靜置15?min；

(2)?在上述錐形瓶中繼續加入20mL四氫呋喃，于超聲波發生器中提取20min，將提取液濾出，殘渣再用10mL四氫呋喃超聲提取5min，再將提取液濾出，將兩次濾液合并；

(3)?將濾液在40℃水浴旋轉蒸發器中濃縮至近干，用甲醇溶解并定容至1mL，然后用氮氣吹干，以含10%－20%甲醇的PBS溶解，即為待測樣品，用于ELISA檢測。

3.根據權利要求2所述二苯甲酮的酶聯免疫檢測方法，其特征在于抗原抗體反應的pH值必須在中性或弱堿性的條件下進行。