[發明專利]穩定指示自噬的高轉移潛能肝癌細胞株及其建立和應用方法

無效

• 申請號: 201010295088.6
• 申請日: 2010-09-29
• 公開（公告）號: CN102115730A
• 公開（公告）日: 2011-07-06
• 發明（設計）人: 樊嘉;史穎弘;彭遠飛;丁振斌
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/91
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 周濂堂

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及一種能夠穩定指示細胞自噬活動同時又具備高轉移潛能的肝癌細胞株，以及該細胞株的建立和應用方法。

背景技術

原發性肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性疾病。其發病率雖只列惡性腫瘤發病率的第六位，但是死亡率卻高居第三位。中國是原發性肝癌高發國，發病人數約占全球的55％。全國第三次死因回顧抽樣調查報告顯示：肝癌是我國惡性腫瘤相關死亡的第二位死因(在城市和男性則是首位死因)。如何有效防治肝癌是我國目前亟需解決的重大問題。

在影響肝癌患者生存的諸多因素中，轉移復發是最為主要的因素。肝癌患者在就診時，多數已發生轉移而無法手術治療，可手術治療率只有15-30％。即使手術，患者術后5年的總體轉移復發率也高達50-80％(多數于2年內復發)。因此，肝癌轉移復發的防治是治療肝癌的關鍵，相關的研究緊要而迫切。

自噬被認為可能在肝癌轉移中起重要作用。自噬是一種細胞自我降解消化的過程，在細胞處于不利于細胞生存的應激條件時，細胞通過循環利用細胞內成份，維持營養和生物能量的穩定，清除受損或多余的蛋白質和細胞器，維持細胞自我穩態，維持細胞生存。其在腫瘤細胞克服不良應激(如缺血缺氧代謝應激、放化療等細胞毒作用等)，維持癌細胞生存，進而促進腫瘤發生發展的重要作用已為近年來的研究證實。由于自噬在維持腫瘤細胞生存中的重要作用，而肝癌細胞轉移又是一個不斷克服不良環境作用的復雜過程，自噬一直被推測可能在肝癌細胞轉移過程中起重要作用。

然而，這種推論一直未能得到很好的研究和證實，究其原因，主要是因為缺乏良好的研究工具和模型。要滿足自噬與肝癌細胞轉移的相關研究，需要有良好的研究用的肝癌細胞株。這個肝癌細胞株需要滿足如下條件：具備高轉移能力，能夠在體內和體外很好地模擬癌轉移過程；具備良好的自噬指示能力，能夠實時顯示自噬的改變并便于聯合其他相關技術觀察分析。

目前的肝癌細胞株尚不能滿足研究所需。這主要是因為：(1)通用肝癌細胞株不具備高轉移能力：目前廣泛使用的肝癌研究工具細胞，如ATCC的HepG2等，不具備高轉移能力，難以在體內和體外良好地復制轉移過程(特別是體內轉移)；(2)自噬指示觀察及快速定量分析方法不足：目前自噬研究采用的自噬觀察方法有很大的局限性，無法完成轉移過程中自噬變化等觀察。目前廣泛用于觀察自噬的方法主要包括透射電鏡、吖啶橙染色熒光顯微鏡或流式細胞術，Western?blot檢測等。這些觀察方法是通過對某個時間點的細胞進行斷點取材觀?察，對于實時動態觀察存在不足，而轉移是一個不斷變化的動態的過程，因此很多過程無法觀測到。例如：在侵襲移動過程中，癌細胞侵透胞外細胞基底膜運動的過程，即使在體外應用Matrigel模擬，這一運動過程中自噬的動態改變通過以上方法也很難觀察；而癌細胞在進出循環系統以及在循環系統內播散時自噬的改變，定植擴增并形成轉移灶時的改變，更難以觀察。此外，這些方法還存在其它不足，如：透射電鏡法樣本制作過程繁瑣，觀察不便，難以定量或半定量分析；吖啶橙染色法特異性差，易于出現假陽性或假陰性結果，可靠性差；Western?blot法檢測步驟多、時程長，工作量大，檢測費用高等。使用GFP綠色熒光蛋白標記LC3形成GFP-LC3自噬報告基因標記細胞使細胞指示自噬，借助熒光顯微鏡觀察自噬活動，是近年來出現的一種新的自噬觀察方法，這種方法使得實時動態觀察自噬改變成為可能。該方法利用自噬發生過程中自噬關鍵分子LC3由LC3-I變為LC3-II，LC3在細胞內的分布發生改變(由LC3-I的細胞胞漿內彌散分布變為LC3-II的富集于自噬體上)，以GFP標記LC3分子，通過熒光分布的改變(由GFP-LC3-I彌散分布于細胞質之彌散綠色熒光變為GFP-LC3-II富集于自噬體上形成綠色熒光亮點)及變化程度來觀察分析自噬的發生和發生強度。理論上，該方法具有實時動態觀察、簡便快捷等諸多優勢，但在實際工作中卻不易實現。其主要問題在于缺乏能夠高效穩定地將GFP-LC3基因導入細胞并使之穩定表達的方法。目前廣泛應用的建立表達GFP-LC3基因的方法是通過脂質體轉染方法(瞬時轉染)將攜帶GFP-LC3基因的重組表達質粒轉入細胞內并使其在細胞內表達。GFP-LC3瞬時轉染法建立的GFP-LC3表達不穩定，導致自噬指示不穩定，細胞在連續傳代后自噬指示減弱或喪失，而轉移過程是一個時間跨度較大的過程，這使得其難以滿足轉移過程的自噬觀察(特別是在體內轉移模型觀察時)。例如：模式生物是高可信的研究方法，應用小鼠或斑馬魚于體內建立轉移模型進行研究是獲得最接近人體試驗結果的可靠方法。而應用人肝癌細胞建立該模型，需要細胞能夠穩定指示自噬，以目前通用的瞬時轉染技術產生的自噬指示細胞，于體內種瘤，在細胞分裂多次瘤生長至一定大小后(遠在癌細胞轉移發生之前)，GFP-LC3自噬指示即減弱或喪失，這使得體內觀察轉移過程中自噬的改變無法實現。傳統的GFP-LC3研究方法除存在上述穩定表達方面的不足外，還存在應用方法方面的嚴重不足：缺乏快速可靠的自噬定量分析方法。傳統的自噬定量方法為人工肉眼計數GFP-LC3自噬熒光亮點，再人工計數細胞，計算獲得平均熒光亮點數/細胞。人工計數工作量很大(每一個處理組總計數細胞量通常在200以上，總熒光亮點計數量通常在1000以上)，尤其是在多因素、大樣本量實驗時工作非常繁重，計數者易于視疲勞計數出錯，可靠性較差，同時人工計數主觀隨意性大，定量分析結果因缺乏足夠客觀性而可信度有限等。此外，傳統的GFP-LC3方法還存在其他一些不足，包括轉染效率低下、轉染試劑具有細胞毒性和自噬誘導作用等。其中轉染試劑的自噬誘導作?用對于自噬的相關研究有較大影響，因為轉染試劑可誘導自噬，并在轉染試劑去除后仍維持較長時間，造成本底背景自噬很高，在背景自噬高的情況下，將難以準確判斷自噬的發生及改變。