[發明專利]紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法

無效

• 申請號: 201010294791.5
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN101953281A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 左示敏;陳夕軍;潘學彪;徐敬友;顧芳;陳宗祥;張亞芳;顧世梁
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: A01G16/00
• 分類號: A01G16/00;A01G7/06
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明公開了一種利用紋枯菌毒素開展水稻抗紋枯病育種的方法，屬于水稻抗病育種技術領域。

背景技術

紋枯病菌在人工培養和侵染過程中均會產生多種對寄主有毒的物質，人們將其統稱為毒素。由于技術手段的局限性，長期以來，一直未有學者獲得紋枯菌毒素純品，因此，關于紋枯菌毒素的成分是什么，至今未有定論。實際研究中采用的毒素均是粗毒素（以下統稱為毒素），為非純品，可能包含一些培養基成分和/或病原菌分泌的對寄主無毒的物質。

少數研究結果預示，毒素可應用于品種的抗病選育。然而，關于具體應用方法，未見報道。本專利主要介紹如何將紋枯病菌毒素應用于水稻抗紋枯病育種中，涉及的背景技術有以下3個方面：

1、毒素提取方法。不同毒素提取方法間的差異主要體現在2個方面，一是提取前的病原菌培養液不同，常用培養液有改良Richard培養液、Czapek培養液和馬鈴薯蔗糖培養液。徐敬友等（2004）研究表明，病菌在改良Richard培養液中產毒能力強于另2種培養液，且發現在25-30℃條件下培養15天的毒素活性最高，培養過程中需要每隔12小時搖晃一次。二是提取方法不同，常用方法有活性炭吸附法、酸度調節萃取法、活性炭吸附萃取法、乙醚萃取法。不同方法間的差異致使獲得的毒素活性或量上存在較大差異，比較顯示，乙醚萃取法獲得的毒素活性最強（孟令軍等，2009）。

總體而言，以上提取方法均是植物病理學專家欲分離純毒素或分析毒素成分而提出的方法，提取過程中均包含一定的純化環節，即去除對寄主無毒的物質。然而，就水稻抗病育種應用而言，在保持同樣產毒量或活性基礎上，這些方法可簡化，使其更方便快捷、經濟實惠。

2、水稻抗毒素測定方法。已報道的水稻抗毒素測定方法有3種，即胚根抑制法、幼苗致萎法和針刺接種法。研究表明，采毒素處理破胸露白的水稻種子，可抑制種子胚根胚芽生長，尤其對胚根生長抑制作用最明顯，處理3葉期水稻幼苗時，可致幼苗萎蔫死亡；通過針刺法將毒素接種于水稻葉片、葉鞘上，可誘發相似于紋枯病的典型癥狀。通過胚根抑制法和針刺接種法，少數研究還發現，一些抗病品種對毒素的忍耐性總體強于感病品種，抗感毒素水平與其抗感紋枯病水平間存在一定正相關性。因此，一些學者推測認為，水稻對紋枯菌毒素的忍耐水平可用作水稻抗病品種的一個篩選標準。

然而，我們研究發現，毒素濃度過高過低均不能有效揭示抗感品種間的抗毒素差異，濃度過高可導致所有測定品種的胚根生長受抑制、幼苗萎蔫致死，受害癥狀相同，抗感差異無法顯示。同樣，濃度過低則不產生抑制或致萎效果，也無法顯示抗感差異。因此，在水稻抗病育種中，一定要采用合適的毒素濃度才能選育到較抗品系（種），但是至目前，還未見到用于水稻抗紋枯病品種選育的合適的毒素濃度的確定方法。

3、水稻紋枯病抗性鑒定方法。在水稻抗紋枯病遺傳和育種研究領域中，已報道的水稻紋枯病抗性鑒定方法主要有捆扎法、撒施法、嵌入法、注射法（潘學彪等，1997）和苗期鑒定法。除了苗期鑒定法在溫室中進行以外，其他方法均在大田進行。田間鑒定的環境不可控，耗時費力，效率低，通常一年只能鑒定一次，每次鑒定耗時也都在2個月以上。苗期溫室接種方法雖然將鑒定周期縮短至1個月左右，且減少了環境影響因素，但是對苗齡大小或植株高矮等要求較高，增加了試驗難度。總體而言，所有這些方法在大規模抗病育種中，都顯得低效、耗時、費力，尤其在低世代分離群體中，缺乏可操作性。

發明內容

本發明為了解決現有技術的不足，提供了一種紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法，該方法簡便快捷，尤其適合在低世代分離群體中應用。

本發明所采用的技術方案是：一種紋枯病菌毒素在水稻抗紋枯病育種中的應用方法，包括以下步驟：

（1）用水稻葉片和純凈水的無菌混合物為培養基培養紋枯菌并提取分泌的毒素；

（2）以紋枯病抗病品種YSBR1、感病品種Lemont為標準品種，將上述（1）中的毒素配成不同濃度梯度對標準品種種子進行胚根抑制法處理，取標準抗病品種YSBR1的胚根抑制率在45-60%之間同時標準感病品種Lemont的胚根抑制率在85%以上時的毒素濃度為最佳毒素濃度；

（3）采用最佳濃度的毒素通過胚根抑制法進行育種篩選，淘汰胚根生長明顯受抑制的品種或個體。

上述步驟（1）中的培養基優選每100ml純凈水中3-4g水稻葉片的無菌混合物。