[發明專利]檢測多刺曼陀羅的引物、試劑及其應用

有效

• 申請號: 201010293942.5
• 申請日: 2010-09-28
• 公開（公告）號: CN102021241A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 印麗萍;易建平;魏莎莎;傅怡寧;方其
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 盧剛

技術領域

本發明涉及農業和植物檢驗檢疫技術領域，具體涉及一種利用分子生物學檢測技術快速準確地檢測多刺曼陀羅(D.ferox)的核酸組合物，采用實時熒光PCR檢測技術，該組合物適用于口岸檢驗檢疫、農業生產和植物保護等領域當中。

背景技術

曼陀羅屬(Datura?L.)，為茄科植物。世界上每年都會發生曼陀羅中毒事件，另外，由于曼陀羅屬許多種被廣泛地用于藥物學和園藝學，因此，該屬許多種在世界各地和我國均有大量栽培，導致該屬在世界范圍內廣泛分布。在進口貨物如大豆中，經常有截獲有毒和有害雜草曼陀羅屬種子的報道，且種子鑒定易發生混淆。目前在國內外文獻中常出現的曼陀羅屬的植物名稱有：多刺曼陀羅(D.ferox)，櫟葉曼陀羅(D.quercifolia)，曼陀羅(D.stramonium)，木本曼陀羅(D.arborea)，美麗曼陀羅(D.candida)，濕地曼陀羅(D.ceratocaula)，異色曼陀羅(D.discolor)，無刺曼陀羅(D.inermis)，毛曼陀羅(D.inoxia)，光曼陀羅(D.leichhardtii)，洋金花(D.metel)，紫花曼陀羅(D.tatula)，柏哈地曼陀羅(D.bernhardii)，紅花曼陀羅(D.sanguinea)等，其中多刺曼陀羅的異名為D.quercifolia。

實際工作中，農產品中夾雜的曼陀羅雜草種子的外觀特征往往會因運輸受到磨損與變形，同時由于環境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同等引起的個體差異，更為形態鑒定增加了難度，而細胞生物學方法等需要的周期比較長且難以準確鑒定。

目前，細胞學研究表明曼陀羅(D.stramonium)和多刺曼陀羅(D.ferox)的隨體和二價體形狀和數目最接近；生物化學的研究表明曼陀羅(D.stramonium)和多刺曼陀羅(D.ferox)的同工酶最近似；在分子水平，利用AFLP技術發現曼陀羅(D.stramonium)和多刺曼陀羅(D.ferox)的相似距離最近，在進化樹上歸為同一組。迄今為止，尚未有分子水平的研究成果可用于鑒定多刺曼陀羅(D.ferox)。

發明內容

本發明的一個目的在于克服上述現有技術中關于形態鑒定和細胞生物學方法存在的困難，提出采用分子生物學的方法，對核糖體內轉錄間隔區(InternalTranscribed?Spacers，ITS)序列差異設計多刺曼陀羅(D.ferox)的檢測用引物。

本發明的另一個目的在于，建立多刺曼陀羅(D.ferox)的PCR檢測方法，將核酸組合物用于口岸檢驗檢疫、農業生產和植物保護等領域當中，以達到快速和準確的檢測鑒定。

本發明提供的檢測多刺曼陀羅(D.ferox)的引物是基于多刺曼陀羅(D.ferox)與其近似種在rDNA內轉錄間隔區序列上的差異設計的。18S～26S核核糖體DNA(nrDNA)的內轉錄間隔區ITS分為ITS1和ITS2兩部分。ITS區在植物核基因組中是高度重復的。全部nrDNA重復單位包括4萬個拷貝以串聯重復(tandemrepeats)方式出現在一個或多個染色體基因位點上(Hamby?R?K，Zimer?EA.Ribosomal?RNA?as?a?phylogenetic?tool?in?plant?systematics?of?plants[M].Chapman?and?Hall，New?York，NY.1992，50～91.)。在被子植物中，ITS區既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性，說明這些間隔區的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如：屬間和種間)解決植物系統發育問題。屈良鵠和陳月琴(1999)(生物分子分類檢索表——原理與方法，中山大學學報(自然科學版)[J].1999，38(1)：1-6)通過對不同生物類群的ITS序列(自生物學數據庫)的比較得出：被子植物大多數科屬的ITS序列的種間差異值為1.2％～10.2％，屬間差異值為9.6％～28.8％，這對系統發育研究來說都是較合適的范圍。

本發明提供的一種檢測多刺曼陀羅的引物，包括核酸引物DF1M和核酸引物DF2。

核酸引物DF1M，即上游引物，其5’端至3’端序列為：TTAAGACGTGCGCGGGCT。

核酸引物DF2，即上游引物，其5’端至3’端序列為：ATGCGTGACGCCCAGGCAGA。

根據核苷酸堿基配對規則可以推知，與本發明提供的核酸引物DF1M和核酸引物DF2核酸序列完全互補的核酸鏈組成的一組核酸組合物也適用于本發明當中。