[發(fā)明專利]艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010293289.2
• 申請(qǐng)日: 2010-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN101979569A
• 公開（公告）日: 2011-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張華堂;徐雯雯;韓妙君;陳玲;郭彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12Q1/68
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及人類基因組的疾病相關(guān)基因的表達(dá)譜研究和特征基因群的篩選。具體的講是在人功能基因組范圍內(nèi)篩選艾滋病相關(guān)基因，利用細(xì)胞模型和基因芯片技術(shù)相結(jié)合的方法建立的艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

艾滋病(AIDS)是一種由HIV(human?immunodeficiency?virus，人類免疫缺陷病毒)引起的嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染病。HIV-1天然的靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的活化和增殖是HIV-1得以大量繁殖和廣泛播散的先決條件。1996年Levine等人意外發(fā)現(xiàn)，經(jīng)同時(shí)包被在磁珠上的CD3、CD28抗體(“CD3/CD28?beads”)刺激后，活化、增殖的CD4+T細(xì)胞，反而獲得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——來(lái)自HIV-1感染者的CD4+T細(xì)胞活化后，能逐漸清除已感染的病毒，來(lái)自健康成人的CD4+T細(xì)胞活化后，能抵抗HIV-1而不被感染。我們以此特殊效應(yīng)為基礎(chǔ)，同時(shí)以高度易感并促進(jìn)病毒增殖的PHA/IL-2活化細(xì)胞為反證，構(gòu)建細(xì)胞模型并篩選出艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群。

本發(fā)明通過(guò)采用高通量的人表達(dá)譜基因芯片，通過(guò)比較未刺激、CD3/CD28磁珠刺激(具備抵抗和清除HIV-1能力)及PHA/IL-2刺激(具備易感和支持HIV-1能力)三種狀態(tài)下的CD4+T細(xì)胞基因表達(dá)差異，篩選在多樣本中有共同表達(dá)趨勢(shì)的差異基因，得到一組艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群，共包含18個(gè)基因，其部分或全部組合作為篩查抗艾滋細(xì)胞藥物的標(biāo)志；該基因群在CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1狀態(tài)時(shí)高表達(dá)或在CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-1時(shí)低表達(dá)，基因群中的各基因的名稱、序列號(hào)及主要描述見表1。

表1??易感和支持HIV-1的特異表達(dá)基因群(共18個(gè)基因)

本發(fā)明中的特異表達(dá)基因群中的基因均參與了造成不同生物學(xué)效應(yīng)的顯著功能(Gene?Ontology，GO)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(pathway)，同時(shí)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(Signal-Net)和基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GeneRelNet)中處于關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)或重要地位，因此具有代表意義。

附圖說(shuō)明：

圖1-a顯示易感和支持狀態(tài)(P)中特異高表達(dá)基因。

圖1-b顯示抵抗和清除狀態(tài)(B)中特異低表達(dá)基因。

具體實(shí)施方式：

1.樣本的選擇和處理

3例樣本取自云南昆明血液中心，均為健康人外周血濃縮白細(xì)胞。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用CD4+T?Cell?Isolation?Kit?II?human試劑盒(Miltenyi公司)對(duì)PBMC進(jìn)行磁珠陰性分選，獲得靜息狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞。使用6孔培養(yǎng)板每孔3ml微量培養(yǎng)體系在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中對(duì)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI?1640完全培養(yǎng)液[RPMI?1640+10％FBS+0.1mol/L?HEPES(上海生工生物公司)]。CD3/CD28磁珠刺激(B組)：按細(xì)胞磁珠1∶3的比例接種1×10⁶CD4+T細(xì)胞/孔(Dynabeads?Human?T-Activator?CD3/CD28，Invitrogen公司)，每2天換半液并傳代，維持細(xì)胞密度為1～2×10⁶細(xì)胞/ml。PHA/IL-2刺激(P組)：接種2×10⁶CD4+T細(xì)胞/孔，加入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素-2(IL-2)進(jìn)行刺激培養(yǎng)，每3天換半液補(bǔ)充PHA和IL-2。上述細(xì)胞刺激6天，連同未刺激(R組)的CD4+T細(xì)胞提取總RNA后作為基因芯片雜交的樣本。

2.基因芯片雜交

2.1總RNA提取及純化

采用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，QIAGENKit純化總RNA，用NanodropND-1000分析RNA濃度，1％瓊脂糖電泳或Agilent?BioAnalyzer?2100進(jìn)行質(zhì)檢。

2.2?cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成

1)取2μgRNA于1.5ml離心管中，如下配置反應(yīng)溶液：

總RNA?2μg(最多6.5μl)

T7Promotor?primer?5μl