[發明專利]快速檢測滴滴涕及其代謝物的酶聯免疫試劑盒及其制法

無效

• 申請號: 201010291388.7
• 申請日: 2010-09-19
• 公開（公告）號: CN102409027A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 劉仁沿;梁玉波;許道艷;劉磊
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及有機氯農藥滴滴涕(1，1，1-trichloro-2，2-bis-p-chlorophenyl-ethane，DDT)及代謝物的檢測技術，特別是涉及一種利用蛋白偶聯合成抗原，制備抗有機氯農藥滴滴涕DDT及其代謝物的單克隆抗體，并涉及利用單克隆抗體與DDT及其代謝物抗原結合，而分析檢測環境樣品中的DDT及代謝物含量的快速方便檢測試劑盒的制法。

背景技術

DDT(1，1，1-trichloro-2，2-bis-p-chlorophenyl-ethane；1，1，1-三氯-2，2-雙-p-氯苯基-乙烷)作為廣譜殺蟲劑曾經在20世紀50年代被大量使用。這一類含氯原子的有機合成殺蟲劑，具有極高的脂溶性和穩定性，可在生物體內富集很高的濃度，在環境中降解緩慢，屬于持久性有機污染物。DDT在沉積物中的兩種主要分解物是2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烯(DDE)和2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烷(DDD)；DDT在動物組織內可以緩慢降解為2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)。DDA本身并不積累，而是作為人或動物與DDT暴露接觸的指標，已報道尿液中DDA的含量可以用作人或其他哺乳動物暴露接觸DDT的靈敏指標。DDT及其代謝產物DDD、DDE等屬于環境內分泌干擾物質，損害動物的神經和生殖系統，長期暴露對肝臟有損害，因此70年代已被發達國家禁止使用，但由于其價格低廉、殺滅蚊蟲效果顯著，至今在一些發展中國家，包括我國的個別地區仍在使用；DDT的羥基同系物三氯殺螨醇(Dicofol)作為農業殺蟲劑尚未被禁用，它含有不低于5％的DDT；因此在食品、環境樣品中甚至南北極仍能檢出DDT和它的代謝物。目前有機氯農藥滴滴涕(DDT)及其代謝物的常規分析方法主要有氣相色譜結合質譜或電子捕獲檢測器方法(GC/MS、GC/FLD)，該方法不僅需要昂貴的儀器設備和專業的分析人員，而且樣品的前處理過程繁瑣復雜，不易滿足大批量樣品的檢測分析需要，也不適用于現場分析。近年來得到快速發展的免疫分析技術，以其特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測迅速和分析成本低的優點被廣泛應用于各種有機污染物的分析。免疫化學方法是通過免疫動物等手段制得特異性抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)，利用抗體和待檢測抗原的結合反應，建立免疫分析方法，用于DDT及其代謝物的分析檢測，該方法簡便、快速，可同時分析大批量樣品。建立有機氯農藥滴滴涕代謝物的快速檢測技術和產品，對了解有機氯農藥滴滴涕的殘留，特別是對于保障食品安全具有十分重大的意義。

發明內容

本發明的目的是克服上述DDT及其代謝物檢測技術的不足，提供一種特異、敏感和簡便的快速檢測DDT及代謝物DDA、DDD、DDE(簡稱DDTs)的試劑盒；本技術發明提供一種抗DDTs的單克隆抗體的制備，并利用抗DDTs單克隆抗體研制的間接競爭酶聯免疫分析DDT及代謝物DDA、DDD、DDE的試劑盒，簡單易操作，適于現場、快速、大批量樣品的分析檢測。

本發明為實現上述目的所采用的技術方案是：一種快速檢測有機氯農藥DDT及代謝物的快速酶聯免疫試劑盒，包括使用水溶性碳二亞胺聯接法，按一定反應比例將2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)偶聯到牛血清蛋白BSA上，經透析提純偶聯物，用120μl加佐劑充分乳化，腹腔注射免疫BALB/C鼠，加強免疫數次后，取免疫鼠的脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞融合，陽性檢測、克隆篩選、擴大培養及誘生腹水制得DDTs的單克隆抗體；用合成的BSA-卵清蛋白(BSA-OVA)包被96孔酶標板，加入DDT及代謝物DDA、DDD、DDE標準品或樣品，再加入稀釋的單克隆抗體Mab-DDTs，包被抗原中的DDA與自由的DDTs競爭抗體Mab-DDTs，自由的DDTs和抗體復合物被洗去，與包被抗原DDA結合的抗體DDA-Mab-DDTs再與辣根過氧化物酶標記的二抗結合，經底物顯色，終止反應，用酶標儀測定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，樣品中自由的DDTs含量越少，對照標準品回歸的方程或曲線，計算樣品中DDTs的含量。

本技術發明的有益效果是：利用制得的含特異性抗DDT、DDD、DDE、DDA的單克隆抗體，所研制的酶聯免疫檢測試劑盒成本低廉、價格便宜，該試劑盒對DDA的檢出限小于7.5ng/ml。

與現有技術相比，本發明具有以下突出優點：本發明的檢測有機氯農藥滴滴涕和代謝物的酶聯免疫檢測試劑盒，具有特異性強，檢測靈敏度高(可達7.5ng/ml)，檢測快速，前處理簡單，檢測成本低，操作簡單易掌握等優點。