[發明專利]一種特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201010290442.6
• 申請日: 2010-09-25
• 公開（公告）號: CN102060923A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 黃新云
• 申請（專利權）人: 武漢紐斯特生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 周發軍

技術領域

本發明屬于生物科學和藥物研發領域。?

背景技術

G蛋白是細胞內主要的信號傳導蛋白，G蛋白中Gα亞基的激活與否是細胞信號傳導的一個標志，對于細胞遷移和分化起著關鍵的信號傳導作用。鑒于其功能，該類蛋白成為細胞生物學和新藥發現即藥物篩選的一個主要研究目標，據統計大約有70％的藥物是通過G蛋白途徑發揮作用的，通過對G蛋白以及相關信號通道激活的檢測是藥物篩選的主要途徑之一。?

G蛋白有兩種構象：與GTP結合時的激活態和GDP結合時的鈍化態。通常情況下，絕大多數G蛋白是與GDP結合的鈍化型。與GDP結合的G蛋白能與各種各樣的受體相互作用，這種相互作用增加了受體與配體的結合親和力。一旦受體與配體結合，受體被激活，α亞基就與β和γ亞基分離，同時離開受體。由于解離下來的α亞基與GDP的結合親和力下降，GDP就能夠與游離在細胞內的GTP發生交換，產生與GTP結合的激活型的G蛋白。被激活的G蛋白就與效應蛋白相互作用，改變了第二信使的濃度，從而發生信號轉導響應。如此這般，配體與受體短短幾毫秒時間的接觸可以延長為幾十秒，乃至更長時間的反應，使輸入的信號可以被大大地放大。?

Gαs是Gα家族中一種，其功能是通過激活，與效應蛋白相互作用，抑制腺苷酸環化酶，降低第二信使的濃度，同時還有更多的理化作用也在逐步揭示中。?

現有的所有針對Gαs蛋白的抗體都只僅僅能監測總的Gαs蛋白水平，無法分辨Gαs蛋白的激活狀態。?

發明內容

本發明的目的是解決上述問題而提供了一種特異性識別激活Gαs蛋白?單克隆抗體及其制備方法，利用本發明的方法制備出的單克隆抗體可以特異性識別Gαs蛋白的激活狀態。?

本發明所采用的技術方案是：?

一種特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體，是由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏號為CCTCC?C201093的雜交瘤產生的。?

一種權利要求1所述的特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：?

1)構建表達Gαs蛋白的表達質粒，表達Gαs蛋白；?

2)通過γ-s?GTP激活Gαs蛋白；?

3)以此激活的Gαs蛋白作為抗原免疫可產生單克隆抗體的動物，完成免疫周期；?

4)融合脾細胞和S/P20細胞，通過激活的抗原篩選出表達特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體的融合細胞株；?

5)以該細胞株的細胞通過可產生單克隆抗體的動物生產，而獲得特異性識別激活Gαs蛋白鼠單克隆抗體。?

優選地，所述可產生單克隆抗體的動物為小鼠、大鼠和兔子。?

進一步地，所述可產生單克隆抗體的動物為小鼠或大鼠時，在步驟5)中以該細胞株的細胞通過小鼠或大鼠生產腹水，而獲得特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體。?

進一步地，所述可產生單克隆抗體的動物為兔子時，在步驟5)中以該細胞株的細胞通過兔子生產血清，而獲得特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體。?

本發明具有以下優點：?

本發明的特異性識別激活Gαs蛋白單克隆抗體，能特異性的識別激活Gαs蛋白，對于Gαs蛋白的激活理化變化研究可以從根本上予以揭示，對于利用Gαs蛋白途徑進行細胞生物學研究和新藥篩選研發起到了關鍵的作用。?

雜交瘤細胞株M08#15，于2010年9月10日在中國典型培養物保藏中心(中國武漢大學)，保藏號為CCTCC?C201093。?

附圖說明

圖1為試驗樣品的免疫印染實驗圖譜；?

圖2為試驗樣品中激活Gαs蛋白含量的標準曲線圖。?

具體實施方式

實施例1?

利用免疫沉淀-免疫印跡結合法來證明本發明的單克隆抗體可以識別激活Gαs蛋白。?

首先需要制備試驗樣品，樣品分為兩種，貼壁細胞樣品和懸浮細胞樣品。?

1.貼壁細胞樣品的制備?

(1)待細胞長到90％的匯合密度時，根據需要加入激活或抑制因子進行細胞刺激。?

(2)吸走培養基，并用預冷的PBS洗滌兩次。?

(3)徹底吸走最后的PBS溶液，并添加預冷的1X的細胞裂解液(每100毫米的細胞培養板加入0.5毫升細胞裂解液)。?

(4)將細胞培養板放置于冰上10分鐘。?

(5)用細胞刮片從細胞培養板上徹底的刮離細胞。?

(6)轉移細胞裂解物到一個大小適合的管中，并放置于冰上。?