[發明專利]一種電化學發光檢測孔雀石綠的方法

無效

• 申請號: 201010288444.1
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN102004099A
• 公開（公告）日: 2011-04-06
• 發明（設計）人: 劉鳳玉;孫世國;楊雪
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 大連八方知識產權代理有限公司 21226
• 代理人: 衛茂才

技術領域

本發明屬于一種高靈敏電化學發光檢測領域，具體涉及一種電化學發光檢測孔雀石綠(無色孔雀石綠)的方法。

技術背景

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學物，既是染料，也是殺菌劑?？兹甘G可致癌，很多國家已經禁用。孔雀石綠價格低廉，治療魚病效果好，尤其是對治療水霉病和小瓜蟲病有特效，而在其病防領域沒有合適的替代藥物出現，因此，仍有漁民在防治魚類感染真菌時使用，也有運輸商用作消毒，以延長魚類在長途販運中的存活時間等，加上使用者對孔雀石綠的危害認識不足，所以導致孔雀石綠禁而不止。研究表明，孔雀石綠的代謝物無色孔雀石綠在魚體內存留的時間更長。因此，開發一種簡單、高效的孔雀石綠(無色孔雀石綠)的檢測方法具有十分重要的意義。

目前孔雀石綠(無色孔雀石綠)的檢測方法主要以理化檢測法和免疫學檢測法為主(劉海新，張農，錢卓真，福建水產，2007(1)，42～45)。理化檢測法包括以下幾種：高效液相色譜法(HPLC)可以檢測生物體內及其他復雜基質中的孔雀石綠和無色孔雀石綠(如飼料原料、化工原料等)，此方法的特點是靈敏度較高。高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS-MS)是近年來發展起來的新的檢測技術，該方法兼具定性功能、靈敏度高，但儀器價格昂貴。還有薄層色譜法(侯云龍，中國刑警學院，1997(4)，19～20)，普通分光光度法(Safarik?I.，Kova?M.，Water?Research，2000，36，196～200)等。薄層色譜法雖然具有簡便快速的特點，但是不能同時檢測孔雀石綠的代謝物無色孔雀石綠。分光光度法：普通分光光度法檢測限較高，靈敏度較低，準確性較差，也不能用于代謝物無色孔雀石綠的檢測，而且僅僅局限于水樣的檢測，尚未見該方法在復雜樣品基質中的應用，僅可用于孔雀石綠原料藥等的測定。免疫學檢測法是指酶聯免疫法(ELISA)，可分為：間接競爭抑制法、抗體/抗原包被直接競爭法和夾心法。采用酶聯免疫試劑盒檢測水產品中孔雀石綠的特點是：檢測速度快，2～3小時就可檢測一批樣品；靈敏度高，該方法特別適合大批量樣品的篩選。雖然ELISA法的抗原和抗體結合有較強的選擇性，但水產品的種類繁多，基質復雜，檢測結果的假陽性幾率高。因此，用該方法檢出的陽性樣還需用高壓液相色譜法或液相色譜質譜聯用法進行定量和確證。

三聯吡啶釕Ru(bpy)₃²⁺電化學發光(Electrochemiluminescence，簡稱ECL)具有原位響應、檢測靈敏度高、線性范圍寬和儀器簡單等優點，在藥物分析、氨基酸分析、DNA探針分析、酶生物傳感器領域得到了廣泛應用。但目前還沒有任何將電化學發光用于孔雀石綠(無色孔雀石綠)檢測的相關報道。我們采用的電化學發光法檢測孔雀石綠(無色孔雀石綠)能達到更低的檢測限和更寬的檢測范圍，操作比較簡單，檢測速度快。

發明內容

本發明的目的是針對現有的孔雀石綠檢測方法，提出一種全新的檢測限更低、檢測線性范圍更寬、靈敏度更高的電化學發光檢測孔雀石綠(無色孔雀石綠)的方法。

本發明的原理是：本發明使用聯吡啶釕類化合物作為發光物質，孔雀石綠(無色孔雀石綠)作為共反應物之一，同時也是被檢測物。將它們分別溶于磷酸或硼酸緩沖溶液中，用電化學方法在0-1.8V電位范圍內對其進行掃描；同時利用光檢測器采集產生的光信號，經數據處理得到檢測結果。由于聯吡啶釕類化合物具有很高的發光效率，即使被測物孔雀石綠(無色孔雀石綠)的濃度很低，該方法仍可檢測到明顯電化學發光響應，并且孔雀石綠(無色孔雀石綠)加入前后體系電化學發光強度的變化與體系中孔雀石綠(無色孔雀石綠)濃度的對數值呈現良好的線性關系，通過計算可以確定體系中孔雀石綠(無色孔雀石綠)的含量。

為達到上述目的，本發明的技術方案是：一種電化學發光檢測孔雀石綠(無色孔雀石綠)的方法，步驟如下：

(1)根據孔雀石綠(無色孔雀石綠)樣品濃度，將10^-7～10^-1mol/L的聯吡啶釕以及待測的孔雀石綠(無色孔雀石綠)樣品分別加入到pH值為3-11的0.1M的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖溶液中；

(2)在任意一款電化學工作站上，對步驟(1)配置的溶液進行掃描；掃描電位范圍0-1.8V；

(3)所述的聯吡啶釕包括單核三聯吡啶釕、以及通過不同長度碳鏈連接的雙核三聯吡啶釕，其代表性結構式如下：

三聯吡啶釕

雙核三聯吡啶釕