[發明專利]多孔樹脂珠粒及使用其制造核酸的方法有效

申請號：	201010287590.2	申請日：	2010-09-17
公開（公告）號：	CN102020813A	公開（公告）日：	2011-04-20
發明（設計）人：	森健二郎;小西達也;前田惠里	申請（專利權）人：	日東電工株式會社
主分類號：	C08L25/12	分類號：	C08L25/12;C08F212/10;C08F212/14;C08F212/36;C08F220/44;C08F8/12;C07H21/00;C07H1/00;C07H21/04
代理公司：	中原信達知識產權代理有限責任公司 11219	代理人：	楊海榮;穆德駿
地址：	日本***	國省代碼：	日本;JP
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摘要：
搜索關鍵詞：	多孔樹脂使用制造核酸方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種多孔樹脂珠粒。更例示性地，本發明涉及含有第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物的多孔樹脂珠粒。所述多孔樹脂珠粒在合成核酸時特別有用。

背景技術

使用亞磷酰胺法的固相合成方法被廣泛用于核酸如DNA寡核苷酸和RNA的化學合成。在所述方法中，例如，首先通過可切割的連接體如琥珀酰基，將成為待合成的核酸的3’-末端的核苷預先負載至固相合成載體上，并且將所述載體放入反應柱中且安置在自動核酸合成儀上。之后，例如，以下列根據所述自動核酸合成儀的合成程序的方式，將合成試劑注入所述反應柱中。(1)通過三氯乙酸/二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯溶液等對核苷5’-OH基進行脫保護，(2)通過核苷亞磷酰胺(核酸單體)/乙腈溶液和活化劑(四唑等)/乙腈溶液，使阿米迪特(amidite)與5’-OH基進行偶聯反應；(3)通過乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等對未反應的5’-OH基進行封端，以及(4)通過碘/水/吡啶等對亞磷酸酯進行氧化。

通過重復所述合成循環，合成了具有預期序列的核酸。通過用氨、甲胺等對可切割的連接體進行水解，將最后合成的核酸從所述固相合成載體中切出(參見非專利文獻1)。

作為在核酸合成中待使用的固相合成載體，迄今已使用CPG(可控孔度玻璃)、硅膠等無機粒子，但是近年來，已經開始使用能夠增加每重量固相合成載體的合成核酸量的樹脂珠粒，以便以合適的價格和大量來進行合成。作為這種樹脂珠粒，例如可提及高交聯且不溶脹的多孔聚苯乙烯珠粒(參見專利文獻1)、低交聯且溶脹的多孔聚苯乙烯珠粒(參見專利文獻2)等。

然而，當將作為合成起點的核苷連接體的負載量增加至太高水平，以便進一步增加重量固相合成載體的合成核酸量時，會造成阿米迪特的偶聯效率變差且獲得的核酸純度顯著降低的問題。例如，可商購的固相合成載體的核苷連接體負載量的上限迄今最多為約200μmol/g，所述負載量的核苷連接體能夠以高純度合成20個堿基的DNA寡核苷酸。

已通過使用丙烯腈抑制多孔樹脂珠粒在各種有機溶劑中的溶脹比波動來進行嘗試以改進核酸合成能力(參見專利文獻3)。然而，盡管該文獻中使用的多孔樹脂珠粒在各種有機溶劑中多孔樹脂珠粒的溶脹比波動小，但是對核酸合成能力還需要進一步的改進。

專利文獻1：JP-A-3-68593

專利文獻2：JP-A-2005-325272

專利文獻3：JP-A-2008-74979

非專利文獻1：核酸化學的當前規程(2000)，第3.6單元，未改性寡核苷酸的合成(Current?Protocols?in?Nucleic?Acid?Chemistry(2000)，UNIT?3.6?Synthesis?of?Unmodified?Oligonucleotides)。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于以高合成量和高純度來合成核酸的多孔樹脂珠粒。

本發明人已首次出乎其意料地發現，在含有第一芳族單乙烯基化合物-二乙烯基化合物-(甲基)丙烯腈-第二芳族單乙烯基化合物共聚物的多孔樹脂珠粒中，當在核酸合成中使用其中

(1)所述第二芳族單乙烯基化合物含有能夠通過脫水縮合反應與羧基結合的基團，并且

(2)干體積為2至3ml/g，

的多孔樹脂珠粒作為固相合成載體時，提高了獲得的核酸合成量并且提高了其純度。

基于這些發現，本發明人已進一步進行深入研究，結果完成了本發明。