[發(fā)明專利]一種酵母表達的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制備方法

無效

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• 申請日: 2010-09-20
• 公開（公告）號: CN102408480A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 王建華;白雪晶;滕達;楊雅麟
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C12N15/12;C12N15/81
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• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制備方法，具體地說是一種牛乳鐵蛋白衍生來源的抗菌蛋白片段的真核表達及其產(chǎn)品制備方法。?

(二)背景技術

乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)是一種天然非血紅素鐵結合糖蛋白，主要由乳腺上皮細胞表達和分泌，廣泛分布于哺乳動物乳汁和其他多種組織及其分泌液中，是哺乳動物非特異性免疫和獲得性免疫反應重要的介導分子。乳鐵蛋白是一個多效性的分子，除全長蛋白的鐵離子結合能力外，乳鐵蛋白及其降解產(chǎn)物如N-lobe、C-lobe、N-端抗菌肽——乳鐵蛋白肽和乳鐵蛋白兩親肽等衍生片段在廣譜抗菌、抗炎癥反應、抑制腫瘤生長、調節(jié)免疫動態(tài)平衡、轉錄調節(jié)、蛋白和核糖核酸酶作用等過程中起直接輔助作用，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品、化妝品和飼料添加劑。?

根據(jù)蛋白藥物分子設計原理和方法，本發(fā)明以抗金黃色葡萄球菌為目標，以牛乳鐵蛋白作為出發(fā)抗菌蛋白模板，創(chuàng)新性設計篩選和高效表達具有特異性抗金黃色葡萄球菌活性的抗菌多肽片段，具有重要的人與動物臨床和預防醫(yī)學意義。金黃色葡萄球菌是人和動物的重要病原菌之一，常引起鼻腔、口腔粘膜以及皮膚和上皮組織的感染，在獸醫(yī)臨床主要引起牛、羊的乳房炎，犬、貓的鼻炎、外耳炎，豬的敗血癥，雞的水腫癥等。金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性球菌病對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，對公共衛(wèi)生尤其是相關從業(yè)人員的生命安全構成嚴重威脅。?

此外，乳鐵蛋白完整分子的工業(yè)化和商業(yè)化應用也已取得了很大進展，已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。美國食品藥品管理局已于2001年批準乳鐵蛋白作為食品添加劑用于運動和功能性食品中，其抗金黃色葡萄球菌的特異性和活性都不是很高，難以滿足臨床和預防醫(yī)學的實際需求。而小分子量抗菌肽的制備和純化存在分離成本很高，價格昂貴，一時難以推廣普及滿足生產(chǎn)需求。應用基因工程技術在體外高效表達重組乳鐵蛋白衍生抗菌片段，提高表達量和結構穩(wěn)定性，有望為解決抗菌肽替代抗生素這一問題提供了有效思路。?

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供的牛乳鐵蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表達及其產(chǎn)品制備方法的目的在于開展牛乳鐵蛋白衍生抗菌分子BLfA的設計篩選、重組畢赤酵母構建和轉抗菌蛋白酵母的高密度發(fā)酵研究，以突破乳鐵蛋白外源表達、翻譯后修飾及重組蛋白純化的技術瓶頸，獲得安全、環(huán)保、高產(chǎn)、高效的基因工程重組乳鐵蛋白及其衍生抗菌蛋白，推進新型抗菌蛋白的工業(yè)化?應用進程。同時將為新型抗菌蛋白的分子設計、構效關系研究和乳源抗菌蛋白產(chǎn)業(yè)化提供理論支持。?

本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)。?

以牛乳鐵蛋白分子序列為出發(fā)模板，借助計算機輔助設計手段，通過分子設計選定抗金黃色葡萄球菌導向的牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA基因序列，全長1032個堿基，編碼344個氨基酸殘基，利用畢赤巴斯德酵母進行真核表達、包括可能發(fā)生的糖基化修飾在內(nèi)，推算表達產(chǎn)生的重組蛋白分子量約為43KD。?

牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段BLfA序列及其推導的氨基酸序列為：?

1??????ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC?

1???????M??A??P??R??K??N??V??R??W??C??T??I??S??Q??P??E??W??F??K??C?

61?????CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG?

21??????R??R??W??Q??W??R??M??K??K??L??G??A??P??S??I??T??C??V??R??R?

121????GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG?

41??????A??F??A??L??E??C??I??R??A??I??A??E??K??K??A??D??A??V??T??L?

181????GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA?

61??????D??G??G??M??V??F??E??A??G??R??D??P??Y??K??L??R??P??V??A??A?