[發(fā)明專利]重型肝炎相關基因hTNFR1 microRNA腺病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其藥學用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010285887.5
• 申請日: 2008-07-18
• 公開（公告）號: CN102010879A
• 公開（公告）日: 2011-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 寧琴;羅小平;習東;高隨;朱傳龍;郭健文;嚴偉明;王鳴
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/63;C12N15/113
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

本發(fā)明是重型肝炎相關基因hfg12、hFas和hTNFR1microRNA腺病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其藥學用途的分案申請，原申請?zhí)?00810133445.1，申請日是2008年07月18日。?

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及構(gòu)建一組基因生物制劑，即構(gòu)建重型肝炎相關的人fg12(Human?Fibrinogen-like?protein?2，hfg12)凝血酶原酶、Fas和腫瘤壞死因子受體I(tumor?necrosis?factor，TNFR1)基因的microRNA腺病毒表達質(zhì)粒，在重型肝炎中聯(lián)合應用三種質(zhì)粒進行治療，驗證其藥學用途。?

背景技術(shù)

由于病毒性肝炎發(fā)病率高、危害性大，已成為嚴重影響人民健康與生活水平、制約經(jīng)濟發(fā)展的重要疾病。迄今為止，國際上對于重型肝炎尚無確定有效的治療方法，探索重型肝炎的發(fā)病機制和防治方法是應用基礎和臨床研究領域的重要課題。?

用鼠3型肝炎病毒(mouse?hepatitis?virus-3，MHV-3)感染不同種系近親繁殖小鼠，我們已成功建立了類似人類各種不同臨床類型的肝炎，包括暴發(fā)型肝炎、慢性肝炎及臨床健康病毒攜帶者(專利申請?zhí)枺?2115980.7)；MHV-3誘導產(chǎn)生的鼠fg12(mfg12)凝血酶原酶(纖維介素)基因在鼠病變肝組織中選擇性高度表達，其基因表達水平與肝組織纖維蛋白沉積及廣泛肝細胞壞死密切相關；MHV-3感染小鼠接?受鼠fg12凝血酶原酶中和抗體注射后可減輕肝臟疾病嚴重程度并顯著降低死亡率。以上結(jié)果表明，鼠fg12凝血酶原酶在鼠暴發(fā)型肝炎的發(fā)病過程中起重要作用。在上述研究的基礎上，我們進一步研究發(fā)現(xiàn)重癥乙型肝炎病人肝臟組織的枯否氏細胞、血管內(nèi)皮細胞和壞死、纖維化區(qū)域發(fā)現(xiàn)人fg12(hfg12)凝血酶原酶高度表達，fg12在病毒性肝炎中引發(fā)肝臟纖維蛋白沉積和微血管內(nèi)微循環(huán)障礙，導致肝細胞壞死，表明人fg12凝血酶原酶在人病毒性肝炎的惡化進展中起著關鍵性的作用。?

重型肝炎的肝細胞死亡包括細胞壞死和細胞凋亡。迅速發(fā)生的凋亡是引發(fā)暴發(fā)性肝炎的重要機制之一。Fas基因廣泛表達于人體組織中，屬于腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)，并被命名為CD95。Fas/FasL通過介導細胞凋亡，在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生中起重要的作用，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病、急慢性肝衰竭和移植性排斥反應等造成肝組織細胞炎癥損傷的重要環(huán)節(jié)。肝細胞對Fas介導的凋亡非常敏感。文獻報導，病毒抗原激活肝細胞表達Fas，局部大量浸潤的CTL表達FasL，引起肝細胞凋亡，肝細胞Fas/FasL表達程度與病變活動性一致，F(xiàn)as介導的肝細胞凋亡在肝損傷中起非常重要的作用。?

腫瘤壞死因子(TNF)包括TNFα和TNFβ，其中TNFα主要是由活化的單核/巨噬細胞分泌，是具有廣泛的生物學活性的多肽調(diào)節(jié)因子，在內(nèi)毒素性休克、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、細胞毒性和抗病毒活動中起著重要作用。TNFα誘導的各種細胞反應是通過細胞表面兩種特異性受體而產(chǎn)生的，即55KD的腫瘤壞死因子受體I(TNFR?I)和75KD的?腫瘤壞死因子受體II(TNFR?II)。TNFα的許多生物學效應包括細胞凋亡都是通過TNFR?I產(chǎn)生的，而TNFR?II則起著輔助信號轉(zhuǎn)導的作用。TNFR?I的高表達所致的肝細胞凋亡在人類重型肝炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。?

臨床上多種病因可致重型肝炎，其發(fā)病兇險，患者短期內(nèi)可出現(xiàn)大面積肝細胞死亡，目前缺乏特異有效的治療手段。研究表明Fas、TNFR?I系統(tǒng)介導的肝細胞凋亡與重型肝炎的肝損傷有關，抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞大量激活并高度集中于患者肝臟，通過Fas/FasL或TNFα/TNFR?I誘導細胞凋亡，進而殺傷肝細胞。hfg12凝血酶原酶在病毒性肝炎中引發(fā)肝臟纖維蛋白沉積和微血管內(nèi)微循環(huán)障礙，導致肝細胞壞死。上述研究表明人fg12凝血酶原酶、Fas/FasL和TNFα/TNFR?I系統(tǒng)在人重型肝炎的惡化進展中起著關鍵性的作用。?