[發明專利]診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白、其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201010284913.2
• 申請日: 2010-09-17
• 公開（公告）號: CN101948521A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 曹建平;蔡輝霞;沈玉娟;韓秀敏;胡媛;王虎;盧濰媛;徐馀信;官亞宜
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/11;C12N15/12;C12N15/70;C12Q1/68;G01N33/53
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白；此外，本發明還涉及上述重組抗原蛋白的制備方法和用途。

背景技術

細粒棘球蚴病又稱囊型包蟲病(cystic?echinococcosis，CE)是一種由細粒棘球絳蟲的幼蟲引起的嚴重危害人體健康和畜牧業發展的人獸共患寄生蟲病，且已成為世界范圍的一個重要的公共衛生、經濟問題。我國棘球蚴病流行嚴重，約占全國總面積的44％，據推算全國棘球蚴病患者數約為38萬人，西部地區尤為嚴重。目前CE確診主要是通過物理影像，如X線、B超、斷層掃描及核磁共振等方法，但由于棘球蚴病患者早期無明顯臨床癥狀，這些方法也僅適用確診中、晚期病患階段，所以早期診斷對該病治療和預后起著重要的作用。對臨床早期可疑病患或對高風險人群進行大規模篩查采用免疫學檢測顯得尤為必要。目前廣泛用于細粒棘球蚴病診斷抗原主要是囊液抗原及其組分抗原B和抗原5等，但受到不易標準化，特異性、敏感性不理想以及與其他帶絳蟲抗原存在交叉反應等問題的限制。尋找具有更高敏感性和特異性的抗原組分，提高對CE的診斷效率，是當前棘球蚴病免疫診斷研究任務中的重要內容之一，而研制特異性快速診斷試劑盒也是目前免疫診斷的發展趨勢。隨著分子生物學技術的發展，用基因工程技術制備重組抗原有助于解決上述問題。近年來，諸多重組抗原已用于CE免疫診斷效果的研究，其中EPC1在免疫診斷方面受到學者的關注。Li等通過感染細粒棘球絳蟲六鉤蚴的小鼠血清篩選細粒棘球蚴cDNA文庫獲得Epc1基因。通過免疫印跡實驗方法證實rEPC1對細粒棘球蚴病患者血清的敏感性為92.2％，特異性為95.6％，是一種新的CE診斷抗原。

根據不完全統計，我國受細粒棘球蚴病威脅的人口在5000萬人以上，但目前對于包蟲病的治療效果尚不理想，所以早期診斷對于人囊型包蟲病(CE)的及時治療至關重要，而具有特異的免疫學診斷對CE的確診有其重要作用。EPC1是Li等從Eg原頭節cDNA文庫篩選得到一編碼為8.4KDa的多肽。將EPC1分截成10段(P1-P10)，通過免疫印跡檢測囊型包蟲病患者血清和感染細粒棘球蚴的實驗鼠血清確定EPC1蛋白的抗體結合部位主要存在于P1、P5螺旋結構的兩多肽段和含P1和P5的EPC1蛋白中，這是EPC1具有特異性血清診斷的主要原因；另外，Epc1蛋白序列與豬帶絳蟲的氨基酸序列有86％的同源性，然而檢測顯示與囊蟲病(豬肉絳蟲囊尾蚴病)僅有9％的交叉反應，主要是EPC1具有B細胞抗原表位，不與囊蟲病患者血清發生交叉反應。

因此，尋找具有更高敏感性和特異性的CE診斷抗原，提高對囊型包蟲病的檢測效率，是當前細粒棘球蚴病免疫診斷研究課題之一。

發明內容

本發明要解決的技術問題之一是提供一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白。

本發明要解決的技術問題之二是提供一種用于診斷細粒棘球蚴病的引物。

本發明要解決的技術問題之三是提供一種上述診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法。

本發明要解決的技術問題之四是提供上述診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的用途。

為了解決上述技術問題，本發明從我國青海省細粒棘球蚴分離原頭節cDNA擴增了Epc1基因片段，克隆表達EgEPC1重組蛋白，通過ELISA方法評價分析重組抗原的診斷價值。

在本發明的一方面，提供一種診斷細粒棘球蚴病的重組抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。編碼上述重組抗原蛋白的基因為SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。

本發明提供一種重組質粒載體，其由上述編碼重組抗原蛋白的基因與表達載體PET28a(+)連接構建。

所述的連接可以采用本領域常規或已知的方法進行，例如：所述的連接可以是將利用內切酶酶切處理含有在細粒棘球蚴抗原蛋白基因兩側帶有限制性內切酶識別位點的克隆質粒得到的細粒棘球蚴抗原蛋白的基因，與經相同酶切處理的表達載體PET28a(+)連接，構建重組表達質粒。所述的內切酶可以是本領域通常使用的內切酶，例如BamH?I、Sal?I。所述克隆質?？梢允菍⑺黾毩＜蝌士乖鞍谆蚺cPGEM-T?Easy載體連接而成的。所述的連接可以是將含所述細粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR產物與PGEM-T?Easy載體連接構建成。所述細粒棘球蚴抗原蛋白基因的PCR產物可以通過抽取細粒棘球蚴總RNA，反轉錄成cDNA作為擴增模板，通過PCR法進行擴增而得。

本發明提供一種轉化體，其由上述重組質粒載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)而得。所述的轉化可以按照本領域的常規或已知的方法進行。