[發(fā)明專利]病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子PXa13及其在病原誘導(dǎo)下調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010284708.6
• 申請(qǐng)日: 2010-09-13
• 公開（公告）號(hào): CN101974528A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王石平;袁婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一段水稻DNA片段的功能驗(yàn)證和應(yīng)用前景分析。所述的DNA片段包含一個(gè)水稻基因的啟動(dòng)子，它能夠在病原物的誘導(dǎo)下特異性地增強(qiáng)基因表達(dá)。

背景技術(shù)

植物在生長的過程中，會(huì)受到多種病原物如病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等的侵害。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果：(1)病原體在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病害；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。

采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗性基因?qū)胫参锸悄壳案牧嫁r(nóng)作物抗病性的主要途徑之一。但是目前的遺傳轉(zhuǎn)化體系存在一些不足，很重要的一點(diǎn)便是轉(zhuǎn)化載體中的啟動(dòng)子大多是組成型表達(dá)啟動(dòng)子。這不僅造成了植物體的負(fù)擔(dān)，使植物在不需要發(fā)生抗病反應(yīng)時(shí)表達(dá)額外的蛋白，造成了浪費(fèi)；嚴(yán)重的還造成了植物體生理和代謝的紊亂，致其產(chǎn)生變異或死亡(Ehsani等，2003；Karlowski等，2003：Miyao等，2003；Durrant和Dong，2004)。

為了解決以上問題，申請(qǐng)人試圖使用特異性啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子是一段對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用的DNA片段。啟動(dòng)子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)間，空間和表達(dá)量起調(diào)控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)有所不同。真核生物有三種RNA聚合酶，每一種都有其識(shí)別的不同啟動(dòng)子。RNA聚合酶II負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)基因和部分snRNA基因的轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。人們比較了上百個(gè)聚合酶II識(shí)別的真核啟動(dòng)子的序列，發(fā)現(xiàn)了一些共同的結(jié)構(gòu)。如1)帽子位點(diǎn)，即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其堿基大多為A，兩側(cè)各有若干個(gè)嘧啶核苷酸，其中A為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。2)TATA框，又稱Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列為：TATAAAA或TATATAT，而在它的兩側(cè)由富含G和C堿基對(duì)的序列組成，一般都位于一35bp附近。TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇，它是RNA聚合酶和DNA鏈結(jié)合的部位。3)CAAT框，其一致序列為GGC(T)CAATCT。一般位于一75bp附近，該框的堿基一旦缺失或突變，將會(huì)造成轉(zhuǎn)錄效率的急劇降低，CAAT框可能控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。4)增強(qiáng)子(enhancer)，又稱為遠(yuǎn)上游序列，一般都在一100bp以上，它對(duì)依賴和不依賴TATA框的轉(zhuǎn)錄均有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。另外，不同的啟動(dòng)子上還有其他不同的順式(cis)調(diào)控元件，它們是反式(trans)調(diào)控因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。不同的反式調(diào)控因子/轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白特異性的與順式調(diào)控元件結(jié)合，對(duì)基因的表達(dá)時(shí)間，空間或表達(dá)量進(jìn)行特異性的調(diào)控。

特異性的啟動(dòng)子分為二類，一是受誘導(dǎo)表達(dá)的特異啟動(dòng)子，二是組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子對(duì)外界的某些物質(zhì)，如病原物，化學(xué)物質(zhì)或逆境作出反應(yīng)，啟動(dòng)植物體內(nèi)相應(yīng)的基因表達(dá)。組織特異型的啟動(dòng)子則驅(qū)動(dòng)基因在特定的組織中表達(dá)。特異性的啟動(dòng)子可避免基因過量表達(dá)對(duì)植物體產(chǎn)生傷害。因此，利用水稻來源的病原物誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性基因的表達(dá)，是改良水稻抗性的最佳選擇之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是對(duì)水稻中分離克隆的一個(gè)感病基因Xa13啟動(dòng)子區(qū)段進(jìn)行功能驗(yàn)證，探索利用這個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控抗性基因的表達(dá)、從而改良水稻的抗病性的前景。這個(gè)啟動(dòng)子被命名為P_Xa13(promoter?of?Xa13)。

本發(fā)明涉及鑒定水稻基因Xa13啟動(dòng)子的DNA片段(P_Xa13)。該片段包含對(duì)病原產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的元件。其中，所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ?ID?NO：1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ?ID?NO：1所示序列的亞片段。可以采用已經(jīng)克隆的P_Xa13啟動(dòng)子作探針，從基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的啟動(dòng)子或同源的啟動(dòng)子。同樣，采用PCR(polymerase?chain?reaction)技術(shù)，也可以從基因組中擴(kuò)增得到本發(fā)明的P_Xa13啟動(dòng)子以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含P_Xa13的序列，將這一序列與基因連接并與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。

將克隆的啟動(dòng)子連接抗性基因轉(zhuǎn)入植物，可以避免植物過量表達(dá)目標(biāo)基因造成的不利影響，這是傳統(tǒng)的組成型啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因的過程中無法做到的。