[發明專利]應用生物反應器工業化生產豬乙型腦炎疫苗的方法

無效

• 申請號: 201010284021.2
• 申請日: 2010-09-15
• 公開（公告）號: CN102038943A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 劉漢平;秦紅剛;朱薇;溫文生;漆世華;李偉;張萍;靖志強
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

技術領域

本發明涉及到獸用生物制品技術領域，具體涉及到一種應用生物反應器工業化生產豬乙型腦炎疫苗的方法。

背景技術

乙型腦炎(Jepanese?Encephalitis，JE)，簡稱乙腦，是一種人蓄共患的蚊媒傳播病毒性疾病，對豬引起豬的繁殖障礙。由于JEV通常在蚊-豬-蚊等動物間循環，豬被認為是JEV最重要的自然宿主，在給養豬業帶來損失的同時，也是人類公共衛生潛在的威脅。目前使用疫苗預防接種仍然是預防該病的有效手段。

當前大規模應用的豬乙腦疫苗有鼠腦滅活疫苗，來自中山株或北京株病毒；細胞培養滅活疫苗，來自北京P-3株病毒；細胞培養減毒活疫苗，來自SA14-14-2株病毒。生產方法雖然相對簡單，成熟，但生產勞動強度大，效率低，疫苗批間差異大，已經越來越不適應當前疫苗大規模生產的要求。

針對乙腦疫苗的生產方法，已有相關文獻的報道。專利公開號為CN101732708A的專利申請，公開了一種利用地鼠腎原代細胞培養乙腦病毒的方法；專利公開號為CN1966075A的專利申請，公開了一種應用二倍體細胞株KMB17培養乙腦病毒的方法，專利公開號為CN1248471A的專利申請，公開一種利用Vero細胞制備乙腦疫苗的方法，其生產方法為轉瓶或生物反應器培養，生物反應器培養微載體用量為2～7g/L，并且是采用批式培養。

以上文獻均涉及到人用乙腦疫苗的制備方法，但生產過程手工操作密集，生產效率低，產品質量不穩定，而且豬乙腦疫苗的生產方法方面的文獻卻不見報道。

發明內容

本發明的目的為了克服豬乙腦疫苗現有生產方法的缺陷，提供一種應用生物反應器工業化生產豬乙型腦炎疫苗的方法，其優點是設備占地面積小、生產規模大；自動化控制程度高，生產效率好；培養設備密閉，不易污染；副產物少，疫苗的副反應??；生產的病毒液滴度高，疫苗質量穩定。

本發明的技術方案為：

應用生物反應器工業化生產豬乙型腦炎疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟：(1)將微載體和生物反應器滅菌后，接種制苗用細胞，進行培養，待微載體上的細胞形成致密的單層，接種乙型腦炎病毒，并繼續培養，使病毒繁殖；所述的制苗用細胞為對豬乙型腦炎病毒毒株敏感的細胞，且為Vero細胞和BHK-21細胞；(2)、待細胞病變達到80％以上時，停止培養，收獲病毒液；(3)對收獲的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通過柱層析方法純化滅活的病毒制成疫苗。

所述的病毒的接種量為0.0001～0.1MOI。

所述的生物反應器設定參數為：pH?6.5～7.8、溫度33～37℃、溶氧30～80％、攪拌速度30～100rpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH?6.8～7.2、細胞培養階段溫度設定37℃，病毒培養階段溫度設定35℃、溶氧50％、攪拌速度30～100rpm。

所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2～25g/L。

所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。

所述的生物反應器容積為14～150L；制苗用細胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐級放大的培養模式，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為種子細胞接種到40L生物反應器，再將40L反應器內培養的細胞消化下來作為種子細胞接種到150L生物反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養過程，從而避免了單純的用轉瓶培養種子細胞而容易造成污染和增加勞動強度的缺陷；于40L或150L生物反應器培養狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反應器培養病毒。

所述生物反應器的培養采用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細胞的密度以每天0.5～4個工作體積。

本發明采用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產豬乙型腦炎疫苗，與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低成本；生產用地少，規模易于擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應小。

附圖說明

圖1為本發明的工藝流程圖。

圖2a為細胞接種后4天的微載體細胞圖片。

圖2b為接毒后細胞狀態的微載體細胞圖片。

圖3為細胞生長曲線。

具體實施方式

以下是本發明一個具體的實施方案，以進一步的闡述本發明，但不能解釋為限制本發明的范圍。

實施例1

生物反應器：美國NBS公司14L和40L生物反應器；

微載體：Cytodex-1(通用電氣醫療集團生命科學部)；