[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于片段長(zhǎng)度分析的甲基化DNA檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010283092.0
• 申請(qǐng)日: 2010-09-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399863A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海迦美生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海新天專(zhuān)利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種甲基化DNA檢測(cè)方法，尤其涉及一種通過(guò)應(yīng)用對(duì)尿嘧啶敏感的特定的DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)甲基化DNA的方法。

背景技術(shù)

DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點(diǎn)的胞嘧啶（C）殘基的5’碳上被修飾了一個(gè)甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見(jiàn)于基因5’端表達(dá)調(diào)控序列。DNA甲基化在基因表達(dá)的調(diào)控中具有重要作用，參與了動(dòng)物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過(guò)程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)互相作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。

DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升高，可以導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機(jī)率就會(huì)提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在腫瘤的早期檢測(cè)中的應(yīng)用，因?yàn)檠芯勘砻鞅碛^遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，檢測(cè)DNA甲基化的改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。

目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉有關(guān)。由于CpG島的局部高度甲基化早于細(xì)胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測(cè)可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)。

CpG島甲基化的檢測(cè)方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性?xún)?nèi)切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測(cè)法。甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶/Southern法（methylation-sensitive?restriction?Endonuclease/Southern，MSRE-?Southern）是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法（Methylation?Specific?PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA檢測(cè)方法，是目前檢測(cè)DNA甲基化的常用方法，具有高靈敏度的同時(shí)，假陽(yáng)性率也很高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測(cè)方法。能夠有效地排除非甲基化DNA的影響，使樣品中的甲基化DNA得以富集，用以解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)靈敏度低、方法復(fù)雜、容易被干擾等缺點(diǎn)。

本發(fā)明甲基化檢測(cè)方法，步驟如下：

步驟1，采用亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA，和標(biāo)準(zhǔn)非甲基化DNA與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA；

步驟2，在要檢測(cè)的目標(biāo)區(qū)域內(nèi)，選擇一段連續(xù)的序列，以這一段連續(xù)序列或以這一段連續(xù)5’端的一部分的作為正向引物，以所選序列3’端下游的一段序列的互補(bǔ)序列作為反向引物；在正向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T7啟動(dòng)子序列作為T(mén)7尾引物，在反向引物的5’末端加上一段20個(gè)堿基長(zhǎng)度的T3啟動(dòng)子序列作為T(mén)3尾引物；合成T3尾引物和T7尾引物，并對(duì)T7尾引物進(jìn)行熒光標(biāo)記；

步驟3，用亞硫酸鹽處理過(guò)的待測(cè)DNA作為模板，用對(duì)尿嘧啶敏感的DNA聚合酶，用步驟2所設(shè)計(jì)并合成的PCR引物，對(duì)待測(cè)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并用已知的標(biāo)準(zhǔn)的非甲基化DNA和甲基化DNA作為對(duì)照，得到PCR產(chǎn)物；

步驟4，以步驟3所得的PCR產(chǎn)物為模板，用Taq?DNA聚合酶，用T3尾引物和熒光標(biāo)記的T7尾引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增；

步驟5，使用DNA序列分析儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度測(cè)定分析，并與標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品結(jié)果對(duì)照；如果檢測(cè)到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品一致，則存在甲基化DNA；如果未檢測(cè)到與標(biāo)準(zhǔn)甲基化DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致的特定DNA片段，則表明樣品中不存在甲基化DNA。

所述步驟1中，所述亞硫酸鹽具體為亞硫酸鈉；所述亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA的方法為，以0.3M的NaOH變性待測(cè)DNA，加入含有5M亞硫酸鈉、0.5mM氫醌的pH值為5.0的混合液，60℃避光溫浴4小時(shí)；脫硫并純化DNA。

所述步驟2中，所選連續(xù)序列大于8個(gè)堿基并包含有至少一個(gè)處在所選連續(xù)序列的中部或靠近3’端的位置的CpG位點(diǎn)，但不出現(xiàn)除CpG位點(diǎn)以外的C。

其中，CpG指的是胞嘧啶（C）、鳥(niǎo)嘌呤（G）和連接二者的磷酸酯鍵（p）組成位點(diǎn)；T指的是胸腺嘧啶，A指的是腺嘌呤。

所述步驟3中，對(duì)尿嘧啶敏感的DNA聚合酶優(yōu)選為耐熱古核菌來(lái)源的DNA聚合酶中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選為pfu?DNA聚合酶。