[發(fā)明專利]檢測(cè)十種主要柑桔病害病原的基因芯片

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010282983.4
• 申請(qǐng)日: 2010-09-16
• 公開（公告）號(hào): CN101956023A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周常勇;王雪峰;李中安;楊方云;宋震;周彥;唐科志;劉金香;劉科宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所 50211
• 代理人: 郭云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種基因芯片，具體的說，涉及一種檢測(cè)主要的十種柑桔病害病原的基因芯片。

背景技術(shù)

柑桔是世界第一大水果，我國柑桔栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，在國民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。近幾年來，隨著我國柑桔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)帶的確立，柑桔的種植區(qū)域更趨集中，面積亦進(jìn)一步擴(kuò)大，而病害問題日益引起生產(chǎn)者的重視。隨著國際柑桔貿(mào)易的持續(xù)增長及種質(zhì)資源交換的日益頻繁，各種檢疫性柑桔病害傳入我國的機(jī)率不斷加大。

柑桔麻風(fēng)病是由柑桔麻風(fēng)病毒（Citrus?leprosis?virus,?CiLV）引起的一類重要柑桔病毒病害，于20世紀(jì)20年代首次在巴拉圭發(fā)現(xiàn)，主要由短須螨（Brevipalpus?spp.）傳播。目前該病主要分布于巴西、阿根廷、巴拿馬、委內(nèi)瑞拉等南美洲國家，嚴(yán)重威脅到北美和加勒比地區(qū)的柑桔產(chǎn)業(yè)，最近在美國佛羅里達(dá)州已檢測(cè)到該病。柑桔鱗皮病是由一種多分體單鏈RNA病毒—柑桔鱗皮病毒(Citrus?psorosis?virus，CPV)引起的病害，主要分布于阿根廷、巴西、意大利、西班牙以及美國等國家，對(duì)柑桔產(chǎn)業(yè)造成十分嚴(yán)重的為害。柑桔雜色褪綠病是由木質(zhì)部難養(yǎng)菌（Xyllela?fastidiosa）引起的一種細(xì)菌性病害，于1987年首次在巴西的圣保羅和Minas?Gerais地區(qū)發(fā)現(xiàn)，由帶病苗木和葉蟬、沫蟬等昆蟲介體傳播。迄今，該病已蔓延到巴西的各個(gè)柑桔產(chǎn)區(qū)和阿根廷、巴拉圭等南美國家。檸檬枝枯病(Mal?secco)是由桔莖點(diǎn)霉(Phoma?tracheiphila)引起的是一種檢疫性真菌病害，主要分布在地中海、黑海地區(qū)，對(duì)許多沿海周邊國家的柑桔生產(chǎn)尤其是檸檬生產(chǎn)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前以上四種病害在我國尚未發(fā)生，但我國存在傳播柑桔麻風(fēng)病毒和木質(zhì)部難養(yǎng)菌的的蟲媒，柑桔鱗片病毒和桔莖點(diǎn)霉亦在我國部分柑桔產(chǎn)區(qū)存在定殖擴(kuò)展的生境，因此檢疫是杜絕該類病害在我國發(fā)生的重要手段。柑桔黃龍病和潰瘍病是國內(nèi)重要的檢疫對(duì)象，柑桔衰退病毒、柑桔碎葉病毒、柑桔裂皮病類病毒和溫州蜜柑萎縮病毒亦是我國發(fā)生的主要病毒類病害。

迄今為止，由于高特異性和靈敏性，PCR和RT-PCR是檢測(cè)以上柑桔病害最為高效的方法，由于柑桔病害種類多，對(duì)每種病害進(jìn)行檢測(cè)較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不宜在我國出入境檢驗(yàn)檢疫中推廣應(yīng)用。因此建立新的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)手段已迫在眉睫。

基因芯片是90年代中期以來發(fā)展極為迅速和活躍的技術(shù)。其原理是將大量DNA探針片段有序的固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的生物樣品中的DNA分子雜交，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析。基因芯片在核酸序列測(cè)定、基因圖片檢測(cè)、基因表達(dá)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

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發(fā)明內(nèi)容

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)柑桔主要病害病原的基因芯片，達(dá)到快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)10種主要柑桔病害病原，以及它們的混合感染，可用于口岸檢驗(yàn)檢疫。

本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)十種主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的特異性寡核苷酸探針，固相載體為光學(xué)級(jí)醛基基片，其關(guān)鍵在于：固定在所述固相載體上的特異性寡核苷酸探針具有SEQ?ID?NO：1-?SEQ?ID?NO：10所示的寡核苷酸序列或者與SEQ?ID?NO：1-?SEQ?ID?NO：10所示的寡核苷酸序列互補(bǔ)的DNA或RNA。

上述固相載體上固定有陰性對(duì)照和作為熒光標(biāo)記對(duì)照的SEQ?ID?NO：11所示的序列。

基因芯片的制備方法：

1．設(shè)計(jì)病原特異性探針：選擇柑桔病原（病毒、細(xì)菌、真菌）保守序列基因?yàn)榘袠?biāo)序列，及上述SEQ?ID?NO：1-?SEQ?ID?NO：11的特異性探針序列。

從GenBank中公布的十種病原中選擇保守基因的為靶序列，從中選取特異性探針，并通過Blast比對(duì)驗(yàn)證。所述的探針見序列表所示。

2.?合成探針：使用上海生物工程有限公司合成儀合成。

3.?探針處理：5’端加T到40個(gè)堿基并在5’端氨基修飾，使它能夠固化在醛基基片上；

4.?基因芯片的制備：使用點(diǎn)樣儀在基片上按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行電樣，將點(diǎn)好的基片在紫外交聯(lián)儀下進(jìn)行交聯(lián)，80℃干烤2小時(shí)備用。

5、雜交及檢測(cè)：取雜交液9μl和加Cy3標(biāo)記PCR產(chǎn)物混合物9μl，42℃恒溫水浴雜交2小時(shí)，洗片掃描觀察結(jié)果。

檢測(cè)時(shí)

1）提取待檢柑桔樣品總核酸備用；