[發(fā)明專利]甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHA10基因家族及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010281925.X
• 申請(qǐng)日: 2010-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN101942458A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柴友榮;馮瑜;趙文軍;陳艷;王瑞;唐章林;李加納;諶利;殷家明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/82;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica?napus)及其親本物種白菜(Brassica?rapa)和甘藍(lán)(Brassica?oleracea)AHA10(autoinhibited?H⁺-ATPase?10，自抑制H⁺-ATP酶10)基因家族及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價(jià)值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個(gè)二倍體物種白菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對(duì)甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對(duì)該性狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對(duì)于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn)基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報(bào)道。

蕓薹屬和擬南芥(Arabidopsis?thaliana)同屬十字花科，具有較近的親緣關(guān)系。原花青素(proanthocyanidin，PA)是形成甘藍(lán)型油菜黑籽顏色的基礎(chǔ)，在黃籽種皮中明顯降低。擬南芥AHA10(AtAHA10)基因參與了種皮中原花青素的聚合，也影響著早期種皮細(xì)胞中液泡的發(fā)育。在擬南芥aha10突變體中，雖然花青素(anthocyanidin)能在種皮中正常的積累，但原花青素的積累量只有非突變體的百分之一，這表明質(zhì)膜H⁺-ATPase參與了原花青素在種皮細(xì)胞中的代謝，特別是在原花青素的聚合過程中起著重要的調(diào)控作用。AtAHA10基因的突變同樣使得突變體種子的種皮呈現(xiàn)出透明種皮的特性。在正常的擬南芥種子發(fā)育早期，種皮內(nèi)層細(xì)胞中能觀察到較大的液泡，而在擬南芥aha10突變體中只能看到一些較小的液泡，但隨著種皮的逐漸成熟，這些差別會(huì)隨之消失，表明該基因的突變導(dǎo)致了液泡發(fā)育的延遲。因此，在蕓薹屬中對(duì)AHA10基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，將有助于揭示甘藍(lán)型油菜種皮色素和早期種皮細(xì)胞中液泡發(fā)育的分子機(jī)理，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑。

蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700～1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種：白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp)和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個(gè)基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個(gè)對(duì)應(yīng)的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個(gè)拷貝。目前，除AtAHA10基因外，尚無其它植物的AHA10基因被克隆，對(duì)AHA10基因的研究報(bào)道較少，而AHA10基因在甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系、轉(zhuǎn)基因分子育種等都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHA10基因家族。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)AHA10基因家族成員的全長cDNA和對(duì)應(yīng)的基因組序列，并進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示：

所述白菜AHA10(BrAHA10)基因家族包括以下2個(gè)成員：BrAHA10-1基因和BrAHA10-2基因；所述BrAHA10-1基因的全長cDNA序列如SEQ?ID?No.2所示，BrAHA10-2基因的全長cDNA序列如SEQ?ID?No.4所示；