[發(fā)明專利]一種酵母工程菌、其制備方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010278464.0
• 申請日: 2010-09-11
• 公開（公告）號: CN102260632A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭永鶴;李永新;黃毓茂;張捷;周洪波
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/29;C12N15/81;A23L1/305;A23L3/3526;A23K1/17;A61K38/16;A61P31/00;C12R1/865
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所 44237
• 代理人: 張全文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母工程菌、其制備方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

抗菌肽是生物體內(nèi)在防御外源病原體入侵時產(chǎn)生的小分子多肽，廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)，除具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和病毒等病原體作用外，還有抗腫瘤細(xì)胞作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景?？咕淖饔脵C(jī)制獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥菌，被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素替代品。美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05是一種新型的抗菌肽，具有巨大的應(yīng)用前景。?

但是抗菌肽在體內(nèi)含量低，分離提純困難，是制約抗菌肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的難題。而且現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)本身也有不足：抗菌肽自身對病原菌具有抑制和殺滅作用，這就難以用原核生物中的大腸桿菌做為表達(dá)系統(tǒng)；使用病毒表達(dá)系統(tǒng)存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，條件不易控制等問題；抗菌肽對真核細(xì)胞沒有抑制作用，但多細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。這些都很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。?

因此，美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因的表達(dá)系統(tǒng)問題，成為影?響美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05應(yīng)用的一大瓶頸。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種酵母工程菌，以解決現(xiàn)有技術(shù)中美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因不能安全、高效表達(dá)的技術(shù)問題。?

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，?

一種酵母工程菌，該酵母工程菌包含由酵母穿梭質(zhì)粒和美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因重組構(gòu)成的重組質(zhì)粒，美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

以及一種酵母工程菌的制備方法，具體步驟如下：?

擴(kuò)增美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因；?

將美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因和酵母穿梭質(zhì)粒重組，得到重組質(zhì)粒；?

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，恢復(fù)培養(yǎng)，得到含有美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因的酵母工程菌，美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步提供上述酵母工程菌在食品、防腐劑、飼料或醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。?

本發(fā)明實(shí)施例的酵母工程菌，使用酵母作為美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因的表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了基因安全、高效的表達(dá)，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。?

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例的重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；?

圖2是本發(fā)明實(shí)施例的重組質(zhì)粒的表達(dá)框示意圖；?

圖3是本發(fā)明實(shí)施例的酵母工程菌PCR凝膠電泳結(jié)果圖；?

圖4是本發(fā)明實(shí)施例的美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05進(jìn)行SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖；?

圖5是本發(fā)明實(shí)施例美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05抑菌試驗(yàn)結(jié)果圖。?

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。?

一種酵母工程菌，該酵母工程菌包含由酵母穿梭質(zhì)粒和美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因重組構(gòu)成的重組質(zhì)粒，美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。?

本發(fā)明實(shí)施例的酵母工程菌中，重組質(zhì)粒由酵母穿梭質(zhì)粒和美洲商路抗菌肽Pa-AMP05基因重組而成，該重組質(zhì)粒在酵母細(xì)胞基因組之外，游離于酵母細(xì)胞質(zhì)之中。酵母穿梭質(zhì)粒是美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05基因的表達(dá)載體。將酵母工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)，其基因組得到表達(dá)，同時本發(fā)明實(shí)施例的酵母工程菌中的重組質(zhì)粒也得到表達(dá)。?

本發(fā)明實(shí)施例中的酵母，包括各種酵母，例如畢赤酵母、釀酒酵母，優(yōu)選的為釀酒酵母，其中釀酒酵母，包括但不限于酒精酵母、漢遜酵母、假絲酵母等，優(yōu)選的為釀酒酵母S78。釀酒酵母含有符合機(jī)體需求的優(yōu)質(zhì)蛋白、膳食纖維、復(fù)合維生素B和有機(jī)鉻、鋅、硒、鐵、鈣等元素，其本身即是一種純天然、無污染、生物態(tài)的健康營養(yǎng)源。釀酒酵母是食品級的表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)產(chǎn)物安全無毒，使得本發(fā)明實(shí)施例的酵母工程菌的表達(dá)產(chǎn)物中不會摻雜有害物質(zhì)。同時酵母遺傳背景清楚，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。?